（環(huán)境科學專業(yè)論文）固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù).pdf

u 11 11 11 11 1111 11 1 1iii y 18 2 9 9 5 8 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 學位論文完成日期：絲? 矽：廠 指導(dǎo)教師簽字： 答辯委員會成員簽字： rflii，；，le2ll 獨創(chuàng)聲明 本人聲明所呈交的學位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的 研究成果。掘我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其 他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含未獲得或其他教育機構(gòu)的學位或證 書使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作 了明確的說明并表示謝意。 學位論文作者簽名：嘲靛簽字吼渺年6 月徊 學位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學位論文作者完全了解學校有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并 向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人 授權(quán)學?？梢詫W位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用 影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學位論文。同時授權(quán)中國科學技術(shù)信息 研究所將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公 眾提供信息服務(wù)。( 保密的學位論文在解密后適用本授權(quán)書) 學位論文作者簽名：刮 ：褐 簽字日期：糾。年月7 7 日 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 摘要 在石油勘探與開采、儲運與煉制過程中，不可避免地會有大量原油和原油制 品拋灑或泄漏于地面，造成大面積土壤的石油污染，對生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害。 由于石油烴類物質(zhì)具有較高的生物學毒性、在環(huán)境中的殘留時間較長且危害大， 如何對受其污染的環(huán)境進行有效修復(fù)日益受到關(guān)注。微生物修復(fù)具有費用低、可 現(xiàn)場處理污染土壤或水體、能夠最大限度地降低污染物濃度和環(huán)境負面影響等特 點，有關(guān)這方面的研究也越來越多。特別是在如何提高降解菌功效方面的研究已 經(jīng)成為國際上的研究熱點。因此，提高石油烴降解菌在土壤中的繁殖效率以及便 于菌劑的擴大化生產(chǎn)與保存、運輸，采取將微生物進行固定化處理的辦法具有重 要意義。 本文從黃河三角洲長期受石油污染的土壤中馴化富集得到對原油具有較好 降解效果的土著的石油烴降解混合菌系，在含有高濃度原油的液體介質(zhì)中檢驗了 該菌系對原油的耐受能力與降解能力，通過分離純化培養(yǎng)，得到三株優(yōu)勢菌種， 經(jīng)鑒定分別為：棒狀桿菌( m i c r o b a c t e r i u m f o l i o r u m ) 、食烷烴戈登氏菌( g o r d o n i a a l k a n i v o r a n s ) 和中慢生根瘤菌( m e s o r h i z o b i u m ) 。 采用四種天然多糖性載體材料將石油烴降解混合菌系制備成固定化顆粒，通 過對固定化顆粒的制備難易、機械強度、傳質(zhì)性等性能的測試，最終選取操作簡 便且機械強度與傳質(zhì)性較高的海藻酸鈉作為載體，并在海藻酸鈉中添加硅藻土以 提高固定化顆粒的機械強度和傳質(zhì)性，通過測定固定化反應(yīng)時間對固定化顆粒中 的微生物活性的影響，最終確定固定化顆粒的制備條件，即采用6 海藻酸鈉2 硅藻土溶液( w v ) 作載體，與等體積的降解菌生理鹽水懸浮液混合均勻，用酸式 滴定管逐滴滴入0 1 m 的c a c l 2 溶液中，固定化反應(yīng)1 2 h ，并測得該方法具有較 高的固定化效率，為9 2 2 5 用掃描電鏡對固定化顆粒的微觀結(jié)構(gòu)進行觀察，顆粒內(nèi)部呈蜂窩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 大部分的降解菌被包埋在孔隙內(nèi)附著生長，顆?？紫抖容^為豐富，利于氧氣、水 分和底物的傳輸，且能夠為固定化細菌提供充分的生長空間，為其在載體內(nèi)的生 長繁殖提供有利條件。 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 將海藻酸鈉固定化顆粒和海藻酸鈉+ 硅藻土的固定化顆粒以三種接種量添加 到原油污染土壤中進行原油降解實驗，調(diào)節(jié)土壤的水分和n 、p 含量至理想水平， 分別以同等接種量的游離菌作對照。結(jié)果表明，固定化降解菌產(chǎn)生了較同等菌量 的游離菌明顯高的降解優(yōu)勢，特別是在實驗初期，接種固定化菌的各組土壤的 t p h 降解率在實驗2 0 天時就已分別達到2 7 2 9 ，2 9 8 3 和2 7 5 6 ，分別比同 等接種量的游離菌高出1 2 4 3 ，1 0 1 0 和6 4 3 ，添加固定化菌的土壤中降解 菌的數(shù)量比添加游離菌的土壤高出1 2 0 1 5 3 個數(shù)量級。并且低接種量的固定化 菌( i l 組) 體現(xiàn)了比高接種量的游離菌( f h 組) 更強的降解優(yōu)勢，2 0 天時，前 者的降解率已比后者高出6 1 ：3 0 天后，各實驗組降解菌的數(shù)量和微生物活性 趨于穩(wěn)定，相應(yīng)的原油降解率也趨于緩慢。另外，所用載體不會破壞土壤結(jié)構(gòu)， 適用于長期大面積石油污染土壤的現(xiàn)場修復(fù)。通過對固定化顆粒的保存條件進行 初步試驗，將固定化降解菌于4 0 c 下分別保存在無菌水及三種保護劑2 0 脫脂乳、 2 0 甘油與液體石蠟中，結(jié)果表明，無菌水是最好的保存介質(zhì)，降解菌在至少3 周內(nèi)都可保持較好的生物活性和顆粒性狀。本實驗的結(jié)果為固定化微生物在大規(guī) 模土壤的實際修復(fù)中的應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。 關(guān)鍵詞：固定化；土壤；石油污染；微生物修復(fù)；土著降解菌 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) bi o r e m e d i a t i o no f c r u d eo i lc o n t a m i n a t e ds o i lw i t h l m m o b l l l z e dm l c r o o r g a n l s m a b s t r a c t i no i l e x p l o r a t i o na n de x p l o i t a t i o n ，d u r i n gt h es t o r a g ea n dt r a n s p o r t a t i o na n d r e f i n i n gp r o c e s s e s ，i n e v i t a b l yt h e r ew i l lb eal o to fc r u d eo i la n d o i lp r o d u c t ss p i l l e d o rl e a k e do n t ot h eg r o u n d ，c a u s i n gal a r g ea r e ao fo i lc o n t a m i n a t e ds o i l ，s o i la n d e c o l o g i c a le n v i r o n m e n to nar a n g eo fh a z a r d s a sp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n sh a v e h i g hb i o l o g i c a lt o x i c i t y ，r e s i d u ei nt h ee n v i r o n m e n tf o rl o n gp e r i o d sa n dc a u s eg r e a t h a r m ，h o wt or e h a b i l i t a t et h ec o n t a m i n a t e de n v i r o n m e n tb e c o m e si n c r e a s i n g l y c o n c e m e db yt h ec o m m u n i t y b i o r e m e d i a t i o n ，b ea b l et ob eu s e df o ri n - s i t u t r e a t m e n t 研t i ll o w - c o s t ，a n dm i n i m i z et h e n e g a t i v e e f f e c t so fp o l l u t a n t c o n c e n t r a t i o n sa n de n v i r o n m e n t a la n do t h e ra d v a n t a g e s ，i sv e r ys u i t a b l ef o ro u r p r e s e n tp r a c t i c a ln e e d s t oe n h a n c et h eb r e e d i n ge f f i c i e n c y o fh y d r o c a r b o n d e g r a d i n gb a c t e r i ai nt h es o i la n dt o f a c i l i t a t et h ee n l a r g e m e n to fp r o d u c t i o n , p r e s e r v a t i o n ，a n dt r a n s p o r t a t i o no ft h ec u l t u r e s ，i tw i l lm a k eg r e a ts e n s et om a k e t h e mi n t oi m m o b i l i z e df o r m e f f i c i e n tb i o d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s mc o n s o r t i u mo fc r u d eo i lo ft h ey e l l o w r i v e rd e l t aw e r ea c c l i m a t e da n de n r i c h e df r o mo i lc o n t a m i n a t e ds o i l t h e i r t o l e r a n c ea n db i o d e g r a d a b i l i t yw a st e s t e db yl i q u i dc u l t u r em e d i u mw h i c hc o n t a i n s h i g hc o n c e n t r a t i o n so fc r u d eo i l t h r e ed o m i n a n ts p e c i e sw e r eo b t a i n e dt h r o u g h i s o l a t i o na n dp u r i f y i n gc u l t u r e ，a n dw e r ei d e n t i f i e d 嬲m i c r o b a c t e r i u mf o l i o r u m ， g o r d o n i aa l k a n i v o r a n sa n dm e s o r h i z o b i u m f o u rk i n d so fn a t u r a lp o l y s a c c h a r i d ew e r ec h o s e nf o rc a r r i e rm a t e r i a l st om a k e t h ec o n s o r t i u mi n t oi m m o b i l i z e db e a d s t h eh a n d l i n gd i f f i c u l t y ，m e c h a n i c a l s t r e n g t h ，a n dm a s st r a n s f e ra b i l i t i e so fb e a dw e r ee x a m i n e d ，a n ds o d i u ma l g i n a t e w a ss e l e c t e da sc a r r i e r ，f o ri t ss i m p l eh a n d l i n g ，s t r o n gm e c h a n i c a ls t r e n g t ha n d m a s st r a n s f e ra b i l i t y a n dt h e nd i a t o m i t ep a r t i c l e sw e r ea d d e dt os o d i u ma l g i n a t et o e n h a n c et h em e c h a n i c a ls t r e n g t ha n dm a s st r a n s f e ro ft h ei m m o b i l i z e db e a d s ，a n d t h ei m p a c to fi m m o b i l i z a t i o nt i m eo nm i c r o o r g a n i s m sa c t i v i t yw a st e s t e da sw e l l i i i 固定化微生物對原油污染十壤的生物修復(fù) f i n a l l yt h ep r e p a r a t i o nc o n d i t i o n so ft h ei m m o b i l i z e db e a d sw e r es e ta sf o l l o w s ： c a r d e rs o l u t i o nc o n s i s t so f6 s o d i u ma l g i n a t e 一2 d i a t o m i t e ( w v ) ，m i x e dw i t hf l l l e q u a lv o l u m eo fd e g r a d i n gb a c t e r i as a l i n es u s p e n s i o n , a n dt h e nb ed r o p p e di n t o o 1m c a c l 2s o l u t i o nw i t ha c i db u r e ta n di n c u b a t e df o r12 h t h ei m m o b i l i z a t i o n e f f i c i e n c yo ft h i sm e t h o di s9 2 2 5 s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ym i c r o s t r u c t u r e so ft h ei m m o b i l i z e db e a d sw e r e o b s e r v e d ，s h o w i n gac e l l u l a rn e t w o r ks t r u c t u r ew i t h i nt h ep a r t i c l e s m o s to ft h e b a c t e r i aw e r ee m b e d d e di nt h ep o r e so ra d h e r e do nt h ew a l l so ft h ep o r e s p a r t i c l e p o r o s i t y i n s i d eb e a di sa b u n d a n t ，w h i c hi sb e n e f i c i a l f o r o x y g e n ，w a t e ra n d s u b s t r a t et r a n s f e r ，a n dc a np r o v i d es u f f i c i e n ts p a c ef o rt h ee m b e d d e dc e l l s g r o w t h t h e r ef o r ，f a v o r a b l ec o n d i t i o n sw e r e p r o v i d e df o rm i c r o o r g a n i s mc e l l s g r o w t ha n d m u l t i p l i c a t i o ni n s i d et h ec a r d e r t h ei m m o b i l i z e dh y d r o c a r b o nd e g r a d i n gb a c t e r i ai nt h r e ei n o c u l u m sw e r ea d d e d t ot h ec r u d eo i lc o n t a m i n a t e ds o i lf o rb i o d e g r a d a t i o ne x p e r i m e n t ，a n ds o i lm o i s t u r e a n dn ，pl e v e l sw e r ec o n t r o l l e dt ot h ed e s i r e dl e v e l t h es a m ea m o u n to ff r e e b a c t e r i aw e r ei n o c u l a t e dr e s p e c t i v e l ya sc o n t r 0 1 1 1 掄i m m o b i l i z e dc o n s o r t i u m a c h i e v e dm u c hh i g h e rr e p r o d u c t i v er a t et p hd e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yi ns o i l ， e s p e c i a l l yi nt h ei n i t i a lp e r i o do ft h ee x p e r i m e n t a f t e ri n o c u l a t e df o r2 0d a y s ，t h e i m m o b i l i z e dc o n s o r t i u mi n o c u l a t e dg r o u p sa c h i e v e dh i 【g ht p h d e g r a d a t i o nr a t eo f 2 7 2 9 ，2 9 8 3 a n d2 7 5 6 ，r e s p e c t i v e l y ，h i g h e rt h a nt h a to ff l e eb a c t e r i aa t 12 4 3 ，10 10 a n d6 4 3 r e s p e c t i v e l y a n dt h ep o p u l a t i o n so fb i o d e g r a d i n g b a c t e r i ai ns o i l si n o c u l a t e di m m o b i l i z e dc o n s o r t i u mw e r eh i g h e rt h a nt h a to ff r e e c o n s o r t i u ma t1 2 0 1 5 3m a g n i t u d e f i n a l l yt h es t o r a g ec o n d i t i o n sf o rt h ei m m o b i l i z e db e a d sw e r et e s t e d w h e nt h e b e a d sa r ek e p ti ns t e r i l i z e dw a t e ra t4 ，t h e yc a nm a i n t a i nb e t t e rb i o l o g i c a l a c t i v i t yf o ra tl e a s tt h e r ew e e k s n er e s u l t so ft h i ss t u d yp r o v i d e sn e wt h e o r e t i c a l b a s i sf o rt h ea p p l i c a t i o no fi m m o b i l i z e dm i c r o o r g a n i s m si nb i o r e m e d i a t i o no fl a r g e a r e a so fc o n t a m i n a t e ds o i l k e yw o r d s ：i m m o b i l i z a t i o n ；s o i l ；o i lc o n t a m i n a t i o n ；b i o r e m e d i a t i o n ；i n d i g e n o u s d e g r a d i n gb a c t e r i a v 固定化微生物對原油污染十壤的生物修復(fù) 目錄 l 引言1 1 1 土壤石油污染現(xiàn)狀1 1 1 1 原油l 1 1 2 土壤原油污染的來源2 1 1 3 土壤原油污染的危害3 1 2 石油污染土壤的微生物修復(fù)4 1 2 1 微生物修復(fù)的基本原理和特點4 1 2 2 石油烴類化合物的微生物降解機理5 1 2 3 土壤中石油烴降解微生物的種群組成6 1 2 4 土壤原油污染生物修復(fù)的影響因素7 1 2 5 石油污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)9 1 3 固定化微生物技術(shù)在土壤修復(fù)研究中的應(yīng)用1 2 1 3 1 吸附法及其在土壤修復(fù)研究中的應(yīng)用1 3 1 3 2 包埋法及其在土壤修復(fù)研究中的應(yīng)用1 5 1 4 本課題的研究意義、研究內(nèi)容與技術(shù)路線1 7 1 4 1 研究意義l7 1 4 2 研究內(nèi)容l8 1 4 3 技術(shù)路線18 1 4 4 創(chuàng)新點1 9 2 材料與方法2 0 2 1 供試土壤2 0 2 2 主要培養(yǎng)基2 0 2 3 石油烴降解菌的馴化富集、降解能力測定及優(yōu)勢菌種鑒定2 0 2 3 1 石油烴降解菌的馴化富集2 0 2 3 2 石油烴降解菌的原油降解能力測定2 l 2 3 3 優(yōu)勢菌種的分離鑒定2 l 2 4 石油烴降解菌的固定化2 l 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 2 4 1 菌懸液的制備2 1 2 4 2 固定化方法21 2 4 3 固定化顆粒的性能測定2 3 2 5 原油污染土壤的修復(fù)實驗2 4 2 5 1 實驗設(shè)置2 4 2 5 2 土壤中t p h 降解率的測定2 4 2 5 3 石油烴降解菌數(shù)量的測定。2 6 2 5 4 微生物活性的測定2 6 3 結(jié)果與分析2 8 3 1 石油烴降解菌的原油降解能力測定2 8 3 2 優(yōu)勢菌種鑒定結(jié)果2 9 3 3 固定化降解菌的制備3 0 3 3 1 固定化載體材料的選擇3 0 3 3 2 固定化顆粒制備條件的優(yōu)化3 2 3 3 3 固定化效率3 4 3 4 原油污染土壤的修復(fù)實驗3 7 3 5 固定化顆粒的保存：4 l 4 結(jié)論4 3 5 問題與展望4 5 參考文獻。4 6 同定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 1 引言 1 1 土壤石油污染現(xiàn)狀 石油是現(xiàn)代經(jīng)濟的主要能源之一，隨著石油產(chǎn)品需求量的增加，大量的原油 及其加工品在開采、冶煉、運輸及儲存等過程中進入土壤，世界范圍內(nèi)的土壤石 油污染日趨嚴重，在油田區(qū)尤為突出。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年約有8 0 萬噸石油進入 環(huán)境【i 】。據(jù)美國e p a ( 2 0 0 0 年) 資料表明：在美國有1 8 億個地下儲油罐，其中2 8 萬個存在不同程度的泄漏。英國3 0 以上的加油站及幾乎所有的化工廠、煉油廠 等均存在嚴重的油類污染；荷蘭迄今為止記錄的石油污染場地有十萬處之多【2 1 ； 我國目前勘探、開發(fā)的油田和油氣田共4 0 0 多個，當前石油年產(chǎn)量已超過1 1 0 k g ，每年新污染土壤1 x 1 0 8k g l 3 1 。在油田區(qū)，平均作業(yè)一口井殘留在地面的落地 原油約l t ，我國石油企業(yè)每年產(chǎn)生落地原油約7 0 0 萬噸，一般井場周圍污染半徑 在1 0 0 0 2 0 0 0 m 之間，井口周圍5 m 范圍內(nèi)為最嚴重污染區(qū)，地面呈黑色，經(jīng)雨水 沖刷污染范圍還會不斷擴大1 4 1 。以地處黃河三角洲的勝利油田為例，該油田區(qū)油 井附近土壤含油量為2 4 8 , 、- 2 5 3 0 0 m g k g - t - - _ ，平均1 5 7 8 2 6 7 m g k g 土【5 1 ，油泥年產(chǎn)生 量約為l1 0 k t ，由于沒有成熟、經(jīng)濟的含油污泥處理技術(shù)和工藝，目前普遍的處 置方法就是在露天進行簡單堆放和填埋，經(jīng)過長年積累該聯(lián)合站現(xiàn)有超過2 0 0 0 0 m 3 含油污泥1 6 l ，使得大面積植被遭到破壞，導(dǎo)致黃河三角洲濕地生態(tài)系統(tǒng)嚴重 退化。 1 1 1 原油 原油是天然有機物質(zhì)經(jīng)過地質(zhì)變遷而形成的一種黑色或黑褐色的粘稠液體 或固體，天然存在于地下或海底，主要由鏈烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等烴類以及少 量硫化物、氮化物環(huán)烷酸類等非烴化合物組成，其中烴類占所有組分的 9 5 9 9 5 ，其化學成分和物理性狀等隨產(chǎn)地的不同而略有不同。有的原油樣品 可含2 0 0 3 0 0 種烴類，不同組分的相對分子量相差很大，從1 6 ( 甲烷) 至1 0 0 0 左右，其物理狀態(tài)可為氣體、揮發(fā)性液體、高沸點液體及固體7 1 。 石油作為推動現(xiàn)代社會高速運轉(zhuǎn)的主要能源已將近4 0 0 年。全世界大規(guī)模丌 采石油始于2 0 世紀初，1 9 0 0 年全世界石油消費量約2 0 0 0 萬噸，1 0 0 年來這一數(shù) 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 量已增長百余倍，目前世界每年的石油總產(chǎn)量為3 0 多億噸【。自從1 8 5 9 年美國 在世界上成功地鉆出第一口油井以來，石油便開始擠身世界重要能源的行列。進 入二十世紀后，在中東發(fā)現(xiàn)了舉世無雙的“石油寶庫”，再加上石油加工技術(shù)的發(fā) 展和石油產(chǎn)品新用途的開發(fā)，石油的地位愈來愈重要，被稱為現(xiàn)代工業(yè)的“血液”， 現(xiàn)代社會中的“黑色金子”i 引。 1 1 2 土壤原油污染的來源 石油工業(yè)迅速發(fā)展的同時造成了諸多的環(huán)境問題，在石油的開采、冶煉、使 用和運輸過程中，由于井噴事故、泄漏及檢修等原因所致的石油烴類的溢出和排 放，以及含油廢水的排放、污水灌溉，各種石油制品的揮發(fā)、不完全燃燒物飄落 等，特別是石油開采過程產(chǎn)生的落地原油，已成為土壤原油污染的重要來源。石 油污染物主要通過以下五種途徑進入土壤： 1 1 2 1 原油泄漏和溢油事故 在我國的石油開采生產(chǎn)過程中，還存在一些不合理的作業(yè)方式，在采油井洗 井和檢修時，會有大量的原油灑落在油井周圍，在原油開采過程中甚至會發(fā)生井 噴事故，此外，石油及其產(chǎn)品在運輸、使用、貯存過程中的滲漏和溢油現(xiàn)象時有 發(fā)生，這些事故往往造成大量石油烴類物質(zhì)直接進入土壤，造成數(shù)量多、濃度高、 危害大的局部污染，使得土壤中的石油濃度大大超過土壤顆粒能夠吸附的量，過 多的石油存在于土壤空隙中，使小范圍內(nèi)的生態(tài)系統(tǒng)遭到完全破壞。目l j i ，我國 勘探、開發(fā)的油田和油氣田共4 0 0 多個，分布在全國2 5 個省市和自治區(qū)，油田的 主要工作范圍近2 0 萬i o n 2 ，覆蓋地區(qū)面積達3 2 萬k m 2 ，其中約4 8 0 萬h m 2 土地的石 油含量可能超過安全值【9 】。 1 1 2 2 含油礦渣、污泥、垃圾的堆置 石油在開采和冶煉時產(chǎn)生大量的含油廢棄物，主要包括含油巖屑、含油泥漿 等。這些含油廢棄物往往堆積在廠礦周圍，在堆放的過程中經(jīng)過雨水的沖刷、淋 洗，向周圍土壤中浸入相當數(shù)量的油，致使土壤中石油烴類含量比非堆放區(qū)高出 數(shù)倍。含油污泥主要來自油田的接轉(zhuǎn)站、聯(lián)合站的油罐、沉降罐、污水罐、隔油 池的底泥。另外，煉油廠含油污水處理設(shè)施也會產(chǎn)生大量的油泥。據(jù)初步統(tǒng)計， 我國石油化學行業(yè)中，平均每年產(chǎn)生8 0 萬t 罐底泥、池底泥，其中，勝利油田每 2 同定化微生物對原油污染十壤的生物修復(fù) 年產(chǎn)生含油污泥在1 0 萬t 以上，大港油田每年產(chǎn)生含油污泥約1 5 萬t ，河南油田每 年產(chǎn)生5 萬t 【10 1 。 1 1 2 3 污水灌溉 使用含油污水灌溉農(nóng)田是土壤受石油污染的主要原因之一。許多工業(yè)廢水含 有石油烴類物質(zhì)，尤其是石油開采、冶煉、加工和以石油為原料的化工部門所排 放的廢水，長期使用這類污水灌溉農(nóng)陽必然導(dǎo)致土壤石油污染。 1 1 2 4 大氣污染及汽車尾氣的排放 石油煉化企業(yè)和工廠在生產(chǎn)過程中，會有石油中的可揮發(fā)性成分進入大氣， 這些成分可與大氣中的顆粒物結(jié)合成降塵進入土壤。有研究表明，大氣降塵污染 區(qū)的土壤礦物油含量比對照區(qū)高出1 2 倍。此外，各種使用汽油、柴油的車輛在 行進中排出的尾氣也含有大量未燃燒的石油成分，這些成分也會以沉降物的形式 進入土壤。因此，公路兩側(cè)土壤中往往含有較多的石油污染物。 1 1 2 5 藥劑污染， 油類經(jīng)常作為各種殺蟲劑、防腐劑和除草劑的溶劑或乳化劑等，當使用這些 農(nóng)藥時，油類就隨之進入土壤，增加了土壤中的石油烴含量。 1 1 3 土壤原油污染的危害 石油烴進入土壤后，雖經(jīng)土壤系統(tǒng)自身的一系列生態(tài)凈化作用其含量會有所 減少，但是如果大量的石油烴類物質(zhì)進入土壤，將會由于其特殊的物理化學性質(zhì) 及其難以去除、殘留時間長的特點，而對土壤和生態(tài)環(huán)境造成一系列的危害，給 污染地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、農(nóng)作物以及人類的健康帶來負面影響，具體可歸納為以下 四個方面： 1 1 3 1 原油污染對土壤性質(zhì)的破壞 油田周圍大面積的土壤一般都受到嚴重的污染，原油對土壤的污染多集中在 2 0c m 左右的表層12 1 。大量石油類物質(zhì)進入土壤，會堵塞土壤孔隙，改變土壤 有機質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)，引起土壤有機質(zhì)的碳氮比( c n ) 和碳磷比( c p ) 的變 化，將會對土壤原有微生物和土壤的酶活產(chǎn)生抑制作用，引起土壤微生物群落、 區(qū)系的變化，破壞土壤微生態(tài)環(huán)境。當土壤礦物油的濃度小于1 0 時，土壤中的 放線菌和總細菌數(shù)不受影響，但真菌數(shù)量明顯減少，固氮菌活性降低，土壤糖類 同定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 的礦化率降低1 5 1 。原油密度比較小，粘著力強且乳化能力低，因而在土壤中容易 與土粒粘連，堵塞土壤孔隙，影響土壤的透氣性和滲水性】。 1 1 3 2 原油污染對農(nóng)作物的危害 石油烴中富含的反應(yīng)基能與土壤中的無機氮、磷結(jié)合并限制硝化作用和脫磷 酸作用，從而使土壤有效氮、磷含量減少，影響作物對養(yǎng)分的吸收；石油還會粘 著在植物的根表面形成粘膜，阻礙根系的呼吸與吸收，引起根系腐爛，影響作物 根系的生長，甚至造成作物的死亡，使作物減產(chǎn)1 5 1 ；重金屬、芳香族化合物等有 毒有害物質(zhì)在農(nóng)作物中產(chǎn)生殘留、富集效應(yīng)，并通過食物鏈的累積放大作用危及 人類健康f 1 引。 1 1 3 3 原油中有毒物質(zhì)對人和動物的危害 石油污染物中的某些脂溶性物質(zhì)能侵蝕中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一些揮發(fā)性組分在紫 外線照射下與氧作用形成有毒性氣體，危害人和動物的呼吸系統(tǒng)【1 3 】。其中芳香 烴類物質(zhì)對人及動物的毒性較大，尤其是以雙環(huán)和三環(huán)為代表的多環(huán)芳烴毒性更 大，具有致癌性、致突變性和致畸性。在石油污染場地以及一些加工煉制的石油 產(chǎn)品中最常見的芳香類污染物質(zhì)為苯、甲基苯、乙基苯和二甲基苯四種，合稱為 b t e x ，它們常被當作芳香烴類污染物的代表物質(zhì)。多環(huán)芳烴類物質(zhì)可通過呼吸、 皮膚接觸、飲食攝入方式進入人或動物體內(nèi)，影響肝、腎等器官的正常功能，甚 至引起癌變。作物和糧食對石油污染物的吸收殘留效應(yīng)使這些有毒物質(zhì)可以通過 食物鏈間接影響人體健康。 1 1 3 4 土壤原油污染對大氣和水體的影響 土壤中的石油組分向空氣中揮發(fā)、擴散和轉(zhuǎn)移，使空氣質(zhì)量下降。原油中不 易被土壤吸附的污染物成分會向土壤下層滲漏從而污染地下水，或被地面降水攜 帶進入地表水體，構(gòu)成對人類生存環(huán)境多個層面上的不良脅迫【b 】。 土壤是人類賴以生存的主要自然資源之一，又是人類生態(tài)環(huán)境的重要部分； 也是物質(zhì)生物地球化學循環(huán)的儲庫，對環(huán)境具有敏感性。土壤石油污染的隱蔽性 大，潛伏期長，涉及面廣，治理困難，危害同益凸現(xiàn)，已成為不容忽視的環(huán)境問 題。 1 2 石油污染土壤的微生物修復(fù) 1 2 1 微生物修復(fù)的基本原理和特點 4 同定化微生物對原油污染十壤的生物修復(fù) 石油污染土壤的修復(fù)，可以采用物理方法、化學方法和生物方法，其中生物 修復(fù)技術(shù)被認為是最有生命力的土壤清潔技術(shù)、是實現(xiàn)生態(tài)效應(yīng)恢復(fù)的最有效措 施，而其中的微生物修復(fù)技術(shù)更是生物修復(fù)的核心技術(shù)。微生物修復(fù)是利用土壤 中的土著微生物或向污染土壤中投入經(jīng)馴化的高效微生物，在適宜條件下通過菌 的代謝活動將存在于土壤中的石油烴污染物降解為無害的無機物質(zhì)( c 0 2 和 h 2 0 ) ，修復(fù)受污染的土壤。降解過程可以由改變土壤的理化條件( 包括土壤的 營養(yǎng)條件、p h 、濕度、溫度等) 來完成，也可通過接種特殊馴化與構(gòu)建的工程 微生物提高降解速率【l4 1 。 與物理化學方法相比，微生物修復(fù)技術(shù)主要優(yōu)點有：成本低，如污染土壤的 生化治理費用于熱處理及物理化學方法；不破壞植物生長所需的土壤環(huán)境；污染 物氧化完全，沒有二次污染：處理效果好，對低分子量的污染物去除率非常高； 可原位處理，避免了集輸過程中的二次污染，節(jié)約了處理費用且操作簡便。 1 2 2 石油烴類化合物的微生物降解機理 石油烴類化合物可分為四類，飽和烴、芳香烴類化合物、瀝青質(zhì)( 苯酚類、 脂肪酸類、酮類、酯類、撲啉類) 和膠質(zhì)( 吡啶類、喹啉類、卡巴胂類、亞砜類 和酰胺類) ，具有一定的微生物降解性。微生物降解原油的理論由美國微生物學 家z o b e l l 首先提出，該理論認為自然界有許多微生物能夠以烴類作為生長的唯一 碳源和能源，而且其利用石油烴的能力主要依賴于烴類混合物中各化合物的性質(zhì) 【i5 1 。石油烴的微生物降解主要包括3 個過程：第一個過程是石油烴在水中的溶解 及在微生物表面的吸附：第二個過程是石油烴在微生物細胞膜的運輸；第三個過 程是t p h 在微生物細胞內(nèi)的降解【l6 1 。降解烴類的微生物吸附在土粒上，它們和烴 液滴的相互作用是在土壤孔隙里的油水界面上進行的，有的烴能直接溶于細胞膜 的親脂區(qū)而進入膜內(nèi)；另一些則是微生物在油滴界面先生成表面活性劑使之溶解 后吸收，氣態(tài)烴要溶于水后才能被吸收1 1 7 】。石油烴類物質(zhì)進入降解微生物的細 胞膜后，在細胞內(nèi)有關(guān)降解酶的催化下通過酶促反應(yīng)進行降解，通過三種同化作 用被降解：好氧呼吸、厭氧呼吸和發(fā)酵作用。微生物降解石油類物質(zhì)主要通過好 氧生物的降解作用產(chǎn)生細胞體和c 0 2 來完成。石油類物質(zhì)的降解并不能簡單看作 某一同化作用，而是一個非常復(fù)雜的過程。簡單來說，這一過程可用下面的公式 表示： 固定化微生物對原油污染土壤的生物修復(fù) 石油烴+ 生物+ 0 2 + 氮源_ c 0 2 + h 2 0 + 副產(chǎn)物+ 細胞體 對各成分的微生物降解性進行比較，認為飽和烴的降解速率最高，其次是低 分子量的芳香族烴類化合物，高分子量的芳香烴類化合物、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)則極難 降解；不同烴類化合物的降解速率模式為：直鏈烷烴 支鏈烷烴 低分子量芳香 烴 多環(huán)烷烴【3 ，1 8 , 1 9 1 。c l a u d e 等例用微生物處理石油烴污染的土壤，實驗2 7 0d 后，7 5 的原油被降解，其中屬飽和烴的正構(gòu)烷烴和支鏈烷烴在1 6 d 內(nèi)幾乎全部 降解；7 8 的環(huán)烷烴被降解；芳香烴有7 1 被同化；占原油總重量1 0 的瀝青質(zhì) 完全保留了下來?？偟膩碚f，烷烴、芳香烴中的c 1 0 一- - c 2 2 最易降解；c i c 6 一般揮發(fā)較快，在環(huán)境中主要以氣體形式存在，而且短鏈烴由于其結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定， 只有少量的微生物對其有降解作用；c 2 2 以上的烴類水溶性很差，一般情況下為 固態(tài)，微生物對其降解作用非常有限。含有支鏈結(jié)構(gòu)和芳香結(jié)構(gòu)的烴類降解速率 比相同個數(shù)碳的直鏈烴要慢，這可能是由于支鏈上的叔碳或季碳影響了其生物降 解過程。研究還發(fā)現(xiàn)，降解環(huán)烷烴需要更多微生物的聯(lián)合作用。同時，c i o 以下 的環(huán)烷烴對微生物膜表現(xiàn)出較強的毒性。在芳香烴部分中，2 環(huán)和3 環(huán)化合物較 容易被降解，而含有5 個或更多環(huán)的那些芳香烴難以被微生物降解；膠質(zhì)和瀝青 則極難被微生物所降解，這些物質(zhì)大量殘留在生物降解的最終產(chǎn)物中，形成降解 后的主要殘留物質(zhì)- 礦化物，【1 2 ，1 9 1 。但也有研究表明，利用特定細菌對石油類 物質(zhì)的共代謝作用可以有效去除某些難降解有機物。b e r t r a n d 等1 2 l j 發(fā)現(xiàn)，難降解 的瀝青和樹脂可以通過共氧化作用進行降解。r o n t a n i 等【2 2 1 也發(fā)現(xiàn)了瀝青質(zhì)的共 氧化作用，同時報道了瀝青質(zhì)的生物降解依賴于烷烴( c 1 2 - - - c 1 8 ) 的存在。 1 2 3 土壤中石油烴降解微生物的種群組成 土壤中存在著大量依靠有機物生活的微生物，如細菌、真菌、放線菌等，具 有氧化分解有機物的巨大能力。在土壤受到石油污染后，一些微生物在污染物的 誘導(dǎo)下產(chǎn)生分解污染物的酶系，可將污染物降解轉(zhuǎn)化。據(jù)報道，能降解石油中各 種烴類的微生物共約1 0 0 余屬、2 0 0 多種，他們分屬于細菌、放線菌、霉菌、酵 母菌以至藻類。土壤中最常見的石油降解細菌群數(shù)由高到低分別為：假單胞菌屬 ( p s e u d o m o n a s ) 、節(jié)核細菌屬( a r t hr o b a c t e r ) 、產(chǎn)堿桿菌屬( 4 i c a l i g e n e s ) 、 棒狀桿菌屬( c o r y n e b a c t e r i u m ) 、黃質(zhì)菌屬( f l a v o b a c t e r i u m ) 、無色菌屬 似c h r o m o b a c t e r ) 、微球菌屬( m i c r o c o c c u s ) 、諾卡氏菌屬( n o c a r d i a ) 和分 6 硎定化微生物對原油污染十壤的生物修復(fù) 支桿菌屬( m y c o b a c t e r i u m ) 。最常見的石油降解真菌種群數(shù)由高到低為：木霉 屬( t r i c h o d e r m a 夕、青霉屬( p e n i c i l l i u m ) 、曲霉屬( a s p e r g i l l u s ) 和森m 屬 ( m o r t i e r e l l a ) 2 3 1 。細菌和真菌是土壤石油生物降解的最基本的作用者，它們 的細胞均含有改變了的脂肪酸組分和較多的核糖體，井常將烴類累積在細胞質(zhì)膜 上，它們也能合成較多的磷脂。一般認為，細菌分解原油比真菌、放線菌容易的 多，但也有研究表明，某些種類的真菌比細菌更能有效地降解原油1 2 4 1 。與真菌 不同的是，多數(shù)細菌依靠烴類混合物生長時，其生長情況要比依靠單個底物時為 好，雖然細菌優(yōu)先利用直鏈的脂肪族緩和，但它們也能利用直鏈烴和芳香烴。 在土壤自然生態(tài)環(huán)境中，上述各種微生物降解石油類物質(zhì)的過程是同步進行 的，并存在著競爭關(guān)系，要區(qū)別每一種細菌在降解過程中的單獨作用是非常困難 的：而且從工程意義上講，往往更注重從宏觀角度探討微生物群落的整體降解效 果。土壤中降解石油微生物的數(shù)量與污染物的存在有著密切關(guān)系，它們能夠適應(yīng) 環(huán)境，然后進行選擇性富集并發(fā)生遺傳改變，從而導(dǎo)致烴類降解細菌所占比例及 編碼降解烴類基因的質(zhì)粒數(shù)量增加。a t l a s 2 5 】曾報道，降解烴類的微生物一般只 占微生物群落總數(shù)的不到l ，而當有石油污染物存在時，降解菌的比例增加到 1 0 。大量研究發(fā)現(xiàn)，在含有原油的土壤中，某些種類的好氧菌類的數(shù)量明顯增 加，但其他好氧菌數(shù)量卻減少了；同時厭氧菌類則沒有受到明顯的影響。另外， 石油污染土壤經(jīng)過一段時間后，生物物種會明顯少于未受污染的土壤1 1 9 】。 目日i 隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)完成對石油烴污染物的降解單株菌種是不可 能完成的，對復(fù)雜混合物石油烴的降解離不丌多種微生物的聯(lián)合作用，因此大量 研究逐漸將研究對象從單株菌種轉(zhuǎn)移到混合菌群。另外，在研究多種微生物共同 起作用時，不同種群問的相互作用也漸漸成為研究課題，如細菌與放線菌就可以 組成良好的組合，放線菌依靠自身伸長的菌絲更易于接近石油烴污染物，而此時 放