（動(dòng)物學(xué)專業(yè)論文）大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定與誘導(dǎo)分化.pdf

iy|ll11iilf17iflfll3llfiif6llllll3frrlrolilll磐 原創(chuàng)性聲明 本人聲明：所呈交的學(xué)位論文足本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)卜進(jìn)行的研究工作及取得的研究成 果。除本文已經(jīng)灃明引用的內(nèi)容外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也 不包含為獲得囪墓直太堂及其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我同工作的同 學(xué)位論文作者簽名： 日期： 盎齬 一掣血乒 指導(dǎo)教師簽 日 期：獬他么： 籮 在學(xué)期間研究成果使用承諾書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：內(nèi)蒙古大學(xué)有權(quán)將 學(xué)位論文的全部?jī)?nèi)容或部分保留并向國(guó)家有關(guān)機(jī)構(gòu)、部門送交學(xué)位論文的復(fù)印件和磁盤，允 許編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，也可以采片j 影印、縮印或其他復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 為保護(hù)學(xué)院和導(dǎo)師的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，作者在學(xué)期間取得的研究成果屬于內(nèi)蒙古大學(xué)。作者今后 使用涉及在學(xué)期間主要研究?jī)?nèi)容或研究成果，須征得內(nèi)蒙古大學(xué)就讀期間導(dǎo)師的同意；若用 于發(fā)表論文，版權(quán)單位必須署名為內(nèi)蒙古大學(xué)方可投稿或公開發(fā)表。 學(xué)位論文作者簽名：名、避 指導(dǎo)教師簽 日期型坦! ! 壁日 內(nèi)蒙i 與大學(xué)碩士學(xué)位淪文 目錄 摘要2 英文縮略詞6 第一章大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、鑒定與誘導(dǎo)分化7 引言7 1 材料與方法9 1 1 材料9 1 2 方法1 1 2 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定1 3 3 大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)染1 7 4 結(jié)果1 8 5 討論2 3 參考文獻(xiàn)2 4 第二章d c a 處理對(duì)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的影響2 7 引言2 7 l 材料與方法2 7 1 1 材料2 7 1 2 方法2 8 2 結(jié)果2 9 3 討論3 1 參考文獻(xiàn)，3 2 結(jié)論3 4 文獻(xiàn)綜述3 5 致謝4 8 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文4 9 焦?jié)扇A大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定與誘導(dǎo)分化 及d c a 處理對(duì)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的影響 摘要 骨骼肌肌肉控制著脊椎動(dòng)物的精確的運(yùn)動(dòng)。成體骨骼肌的組成單元是肌纖 維。肌纖維是由一群處于有絲分裂間期的成肌細(xì)胞組成的合胞體。而未分化的 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞參與了合胞體的修復(fù)和維持。 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞是未分化的單核肌源性細(xì)胞群落，在哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、 鳥類、兩棲動(dòng)物的骨骼肌內(nèi)都能發(fā)現(xiàn)。1 9 6 1 年在蛙的肌肉中首先發(fā)現(xiàn)了衛(wèi)星細(xì) 胞的存在。電鏡觀察提示衛(wèi)星細(xì)胞位于骨骼肌纖維的肌細(xì)胞膜與基底膜之間， 其核較大、胞漿少，細(xì)胞器數(shù)量少。這些特征說明衛(wèi)星細(xì)胞處于有絲分裂靜止 期，其轉(zhuǎn)錄活性低于肌纖維。 由于能夠從病人骨骼肌中獲得并在體外大量擴(kuò)增，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞可以作為 細(xì)胞移植的資源，并且已經(jīng)應(yīng)用于骨骼肌和心肌的重建。盡管發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細(xì)胞的 存在已經(jīng)有5 0 多年的歷史了，但分離鑒定肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的方法仍然具有不穩(wěn)定 性。 本研究使用兩步酶消化和差速貼壁相結(jié)合的方法分離大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞。 d e s m i n 免疫細(xì)胞化學(xué)染色、m y f 5 及m y o d l 的r t - p c r 法證明了所分離的細(xì)胞足肌 肉衛(wèi)星細(xì)胞。成肌和成脂誘導(dǎo)試驗(yàn)證明了所分離的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞具有多分化潛 能。 內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文 主要研究結(jié)果如下： 1 通過兩步酶消化和差速貼壁相結(jié)合的方法分離得到了肌肉細(xì)胞系。 d e s m i n 免疫細(xì)胞化學(xué)染色、尬筘及蜘d d 珀勺r t - p c r 法證明了所分離的 細(xì)胞是肌肉衛(wèi)星細(xì)胞。 2 分離得到的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞能夠向成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能，具 有一定的多能性。 3 d c a 處理促進(jìn)了肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的增殖并激活了w n t b e t a c a t e n i n 信 號(hào)通路。 關(guān)鍵詞：大鼠，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，成肌誘導(dǎo)，成脂誘導(dǎo)，f a t 1 焦?jié)扇A大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fr a tm u s c l es a t e l l i t ec e l l s a b s t r a c t p r e c i s ev o l u n t a r ym o v e m e n ti nv e r t e b r a t e si sa c h i e v e db yt h ef i n ec o o r d i n a t e d c o n t r o lo fs k e l e t a lm u s c l e s t h em y o f i b e r ，t h ec e l l u l a ru n i to fa d u l ts k e l e t a lm u s c l e ，i s ah i g h l ys p e c i a l i z e ds y n c y t i u ms u s t a i n e db yh u n d r e d so fp o s t - m i t o t i cm y o n u c l e i t h e r e p a i ra n dm a i n t e n a n c eo ft h i ss y n c y t i u mi sc o n v e n t i o n a l l ya s s i g n e dt oap o o lo f u n d i f f e r e n t i a t e dm y o g e n i cp r e c u r s o r s ，s a t e l l i t ec e l l s 。 m y o b l a s t sh a v eb e e nw i d e l yu s e d t or e g e n e r a t es k e l e t a la n dc a r d i a cm u s c l e sa n d h o l dp r o m i s ea sac e l ls o u r c ef o rc e l lt r a n s p l a n t a t i o nb e c a u s et h e yc a ne a s i l yb e h a r v e s t e df r o map a t i e n t ss k e l e t a lm u s c l ea n dc u l t u r ei nv i t r o s a t e l l i t ec e l l sa r er e g a r d e da sap o p u l a t i o no fm u s c l e - s p e c i f i cc o m m i t t e d p r o g e n i t o r st h a t a r er e s p o n s i b l ef o rt h ep o s t n a t a lm a i n t e n a n c e ，g r o w t h ，r e p a i ra n d r e g e n e r a t i o no fs k e l e t a lm u s c l e s a l t h o u g hs a t e l l i t ec e l l sw e r ef i r s ti s o l a t e d5 0y e a r s a g o ，t h ei s o l a t i o np r o t o c o l sa r es t i l l l e s se f f i c i e n ta n dn e e d e dt ob em o d i f i e d i nt h i s s t u d y ，t h ec o m b i n a t i o no ft w o s t e pe n z y m ed i g e s t i o na n dp u r i f i e dw i t hd i f f e r e n t s p e e da d h e r e n c ep r o t o c o l sw e r eu s e d t oi s o l a t er a ts a t e l l i t ec e l l s a n a l y s e so ft h ec e l l s w i t hd e s m i ni m m u n o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n ga n de x p r e s s i o n so fm y f 5a n dm y o d l s h o w e dt h a tt h e yw e r es k e l e t a lm u s c l es a t e l l i t ec e l l s t h e s ec e l l sc a nb ei n d u c e di n t o 4 內(nèi)蒙t 與大學(xué)碩士學(xué)位論文 b o t h m y o b l a s ta n da d i p o g e n e s i s ，w h i c hs h o w e dt h a tt h e s ec e l l sw e r ep l u r i p o e n t t h e s ec e l l sw e r eu s e da sr e c i p i e n t sf o rt r a n s f e c t i o no ff a t 1g e n ew h i c hd e r i v e df r o m w o r m ( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) k e yw o r d s ：r a t ，s a t e l l i t ec e l l s ，m y o b l a s t ，a d i p o g e n e s i s ，f a t - 1g e n e 5 焦?jié)扇A大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 英文縮寫 b s a d a b d c a d m s o d m e m f 1 2 e d t a f b s h r p m t t p b s p c r r t - p c r 英文縮略詞 a b b r e v i a t i o n s 6 中文全稱 牛血清白蛋白 二氨基聯(lián)苯胺 脫氧膽酸 二甲亞砜 d m e m f 1 2 培養(yǎng)基 乙二胺四乙酸 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 辣根過氧化物酶 噻唑藍(lán) 中性磷酸鹽緩沖溶液 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 內(nèi)蒙 大學(xué)碩士學(xué)位論文 實(shí)驗(yàn)部分 第一章大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、鑒定與誘導(dǎo)分化 引言 成體干細(xì)胞具有兩大功能：自我更新和多分化潛能。它們負(fù)責(zé)著組織和器官的發(fā)育與再 生。間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層來源的具有多分化潛能的成體干細(xì)胞。在不同的誘導(dǎo)條件下具有 向中胚層細(xì)胞分化的能力，同時(shí)還可以分化為外胚層的神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞。間充質(zhì) 干細(xì)胞的分化受一系列關(guān)鍵基因的激活的調(diào)控。這些關(guān)鍵基因包括m y o d , r u n x 2 c b f a i ， o s t e r i x ( o s x ) 和p p a r r 。m 陽鐘專錄因子家族對(duì)于肌形成是必須的( 1 ) ；r u n x 2 c b f a l 和o s t e r i x ( o s x ) 對(duì)于骨形成是必須的( 2 4 ) ；而p p a r r 靈卉丁于脂肪形成是必須的( 5 7 ) 。 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞是一種起源于胚胎中胚層的干細(xì)胞。在發(fā)育成熟的個(gè)體，是位于肌纖維槳 膜和基底膜之間的一群小的單核梭形細(xì)胞，處于靜息狀態(tài)。當(dāng)肌肉受到損傷等刺激條件下， 激發(fā)其進(jìn)入有絲分裂循環(huán)，提供肌肉修復(fù)的細(xì)胞。新生的細(xì)胞可以相互融合形成新的肌束， 或融入已有的肌束，修復(fù)肌組織損傷。所以，衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌再生的儲(chǔ)備。利用這些特性， 在臨床上可以從病人的骨骼肌中分離得到肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，并利用這些肌肉衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行骨骼 肌和心肌等的重建，并取得成功( 8 1 2 ) 。 盡管發(fā)現(xiàn)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的存在已經(jīng)有5 0 多年的歷史了，并在體外進(jìn)行了一些嘗試，但 是，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離與鑒定的方法仍然具有不確定性。目前，常用的分離方法主要是采 用肌束分離培養(yǎng)法，其分離效率、培養(yǎng)保持、鑒定等都有待于提高。往往是從動(dòng)物的四肢分 離出肌肉組織，經(jīng)過簡(jiǎn)單的膠原酶和胰蛋白酶即雙酶消化得到細(xì)胞懸液，再將這些細(xì)胞懸液 直接培養(yǎng)成細(xì)胞系。實(shí)際上，這樣建立起來的細(xì)胞系，其細(xì)胞成分復(fù)雜，除部分是衛(wèi)星細(xì)胞 外，成肌細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等都混雜其中。在鑒定方法上，也都存在值得商榷的 之處。大多只是通過d e s i m i n 染色染色就斷定是衛(wèi)星干細(xì)胞，而沒有作干細(xì)胞表面標(biāo)志的檢 測(cè)( 1 3 1 4 ) 。由此得到的細(xì)胞很難判定為衛(wèi)星細(xì)胞。建立有效的肌肉衛(wèi)星細(xì)胞分離、純化、 焦?jié)审靡豢訅嬎苣仕軌櫵苒心核芏瑚M壅皇鋈墨坌些 一 - ，_ _ - _ - - _ _ - _ ，_ ，_ 一一一 培養(yǎng)、保持的實(shí)驗(yàn)方法，是衛(wèi)星細(xì)胞應(yīng)用的前提條件。得到的衛(wèi)星細(xì)胞還需經(jīng)過誘導(dǎo)分化以 證明其多潛能特性。 本研究以大鼠為材料，通過雙酶消化、差速貼壁、多次分離等方法分離肌肉衛(wèi)星細(xì)胞， 通過d e s i m i n 免疫熒光染色、m y f 5 、叼，d d j 的r t - p c r 等技術(shù)進(jìn)行鑒定，并且通過誘導(dǎo)處理誘導(dǎo) 犀細(xì)胞形成朋管、脂肪細(xì)胞，以證明其多分化潛能。 內(nèi)蒙t 與大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 材料與方法 1 1 材料 1 1 1 試驗(yàn)動(dòng)物 1 0 日以內(nèi)的大鼠乳鼠，健康無病，購(gòu)買于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 1 1 2 試驗(yàn)試劑及耗材 型膠原酶、地塞米松、胰島素、d m s o 、油紅o 購(gòu)買于s i g m a 。瓊脂糖為p r o m e g a 公 司產(chǎn)品，凝膠回收試劑盒為a x y g e n 公司產(chǎn)品。r n a 提取試劑盒( r n a i s or e a g e n t ) ，反轉(zhuǎn)錄 試劑盒，s y b rp r i m e s c r i p tp c r 試劑盒，1 0 0 b pm a r k e r 、無酶水( d e p c 水) 等試劑購(gòu)自于寶 生物工程( 大連) 有限公司。脂質(zhì)體l i p o f e c t a m i n e t m2 0 0 0 購(gòu)自i n v i t r i g e n 公司。明膠購(gòu)買于 華美生物工程公司。胰蛋a 酶、d m e m f 1 2 購(gòu)買于i n v i t r o g e n 。胎牛血清、馬血清購(gòu)買于g i b c o 。 小鼠抗大鼠d e s m i n 抗體購(gòu)買于武漢博士德；氯仿和異丙醇及其它常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 3 5 m m 培養(yǎng)皿、6 0 m m 培養(yǎng)皿以及1 0 0 m m 培養(yǎng)皿均購(gòu)自c o m i n g 公司 1 1 3 試驗(yàn)儀器與器械 c 0 2 培養(yǎng)箱( g a l a x ya ，r x b i o t e c h ) 、小型恒溫水浴鍋( g r a n tg d l 0 0 ) 、超凈工作臺(tái) ( z h t c h e n g ，z h j h 1 1 1 2 b ) 、立體顯微鏡( n i k o ns m z 1 0 、n i k o ns m z l 5 0 0 ) 、倒置相 差顯微鏡( n i k o nb i o p h o t ) 、中型冷凍臺(tái)式離心機(jī)( h e t t i c hz e n t r i f u g e nu n i v e r s a l3 2 r ) 、 小型冷凍臺(tái)式離心機(jī)( e p p e n d o r fc e n t r i f u g e5 4 1 5 r ) 、微型臺(tái)式低速離心機(jī)( t o m y c a p s u l e f u g ep m c 8 8 0 ) 、精密電子天平( s a r t o f i u sb l 3 1 0 、c p 2 2 4 s ) 、臺(tái)式酸堿度計(jì) ( m e t t l e rt o l e d od e l t a3 2 0 ) 、小型臺(tái)式高頻振蕩器( i k am s im i n i s h a k e r ) 、超低溫冰 箱( s a n y om d f u 3 2 v ) 、常規(guī)冰箱( h a i e rb c d 2 1 9 s ) 、液氮容器( c r y o g e n i c e q u i p m e n t ) 、烘箱( h e n g f e n gs f g 0 2 4 0 0 ) 、自動(dòng)滅菌鍋( h i r a y a m ah v e 5 0 ) 、純 凈水過濾裝置( l a b c o n c ow a t e rp r op s ) 。 1 1 4 實(shí)驗(yàn)所需溶液的配制 ( 1 ) d m e m f 1 2 基本培養(yǎng)液： 9 焦?jié)扇A大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 表1 1 d m e m f 1 2 配方 t a b l e1 - 1 t h er e c i p eo fd u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m ：n u t r i e n tm i x t u r ef 一12 ( h a m ) ( 1 ：1 ) 注：混勻后，用i nn a o h 調(diào)整p h 值至7 2 ，以0 2 2 9 m 濾器過濾除菌并分裝成9 0 m i f f s , ，4 保存?zhèn)溆?。使用前加入l o m l 瓶f b s 即可。( 其它袋裝d m e m f 1 2 按照其配方要求配制即可) ( 2 ) d - p b s ( d u l b e c c o sp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) 緩沖液： 表1 - 2 d p b s 配方( 不含鈣、鎂) t a b l e1 - 2 t h er e c i p eo fd u l b e c c o sp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 注：調(diào)整p h 值至7 4 ，1 0 5 k p a ( 1 2 1 ) 高壓滅菌3 0 r a i n 后4 c 保0 0 - 備用。( 如果使用袋裝d - p b s 粉劑，則直接按照配制說 明溶解、混勻和滅菌分裝即可) ( 3 ) 胰蛋白酶溶液：0 2 5 t r y p s i n + 0 0 2 e d t a + p b s ：精密電子天平稱取0 2 5 9t r y p s i n 、 0 0 2 9e d t a 加入d p b s 溶液10 0 m l 中，0 2 2 9 m 濾器過濾除菌后，以10 m l 管分裝在15 m l 螺 口離心管中，4 c 保存?zhèn)溆谩?( 4 ) 抗生素貯存液( 青霉素液、鏈霉素液) ：p e n i c i l l i n x l 0 0 0s t o c k ( 1 0 0 ，0 0 0 l u m l ，有效 作用濃度1 0 0i u m 1 ) ：稱取青霉素( b e n z y l p e n i c i l l i np o t a s s i u m ，w a k o ) 粉末0 6 9 9 3 9 溶于1 0 m l d 6 h 2 0 中，0 2 2 9 m 濾器過濾除菌，以l m l 管分裝在1 5 m l 規(guī)格e p p e n d o r f 管中，一2 0 。c 凍存?zhèn)?用。s t r e p t o m y c i n x l 0 0 0s t o c k ( 1 0 0 ，0 0 0 9 9 m l ，有效作用濃度1 0 0 r t g m 1 ) ：稱取鏈霉素 ( s t r e p t o m y c i ns u l f a t e ，w a k o ) 粉末1 0 0 0 0g 溶于l o m ld 6 h 2 0 中，0 2 2 9 m 濾器過濾除菌，以 1 0 內(nèi)蒙占大學(xué)碩士學(xué)傍論文 l m l 管分裝在1 5 m l 規(guī)格e p p e n d o r f 管，2 0 c 凍存?zhèn)溆谩?( 5 ) 細(xì)胞冷凍液：每次使用前以d m s o ( 二甲亞砜) ：f b s ：d m e m f 1 2 - 1 ：2 ：7 比例新鮮 配制細(xì)胞冷凍液。 ( 6 ) 油紅o 原液：0 5 9 油紅o ，溶于1 0 0m l 異丙醇，6 0 。c 過夜，自然冷卻，中性濾紙過 濾，常溫保存。 ( 7 ) 油紅o 工作液：臨用時(shí)取6m l 油紅o 原液加4m l 雙蒸水，過濾后使用。 ( 8 ) 0 1 的明膠：稱取0 5 9 明膠晶體溶解于l o o m ld 6 h 2 0 高壓蒸汽滅菌后4 c 保存。 ( 9 ) 細(xì)胞固定液等按照常規(guī)方法配制。 0 0 ) g 4 1 8 貯存液：先配制l o o m mh e p e s 溶液( p h 7 4 ) ，稱取1 3 0 1 5 9h e p e s ，溶于5 0 m l d 6 h 2 0 ，調(diào)節(jié)p h 值至7 4 。量取2 0 m l1 0 0 m mh e p e s 溶液，加入l g 包裝g 4 18 中，配制成5 0 m g m l 濃貯液，0 2 2 9 m 濾器過濾除菌，l m l 管分裝在1 5 m l 規(guī)格e p p e n d o r f 管、一2 0 c 凍存。 1 2 方法 1 2 1 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離 選取1 0 日齡以內(nèi)s d 大鼠2 只。7 5 酒精室溫浸泡1 5 分鐘，無菌條件下取腿部肌肉并 將肌肉置于平皿中。用p b s 沖洗兩遍，顯微鏡下盡可能剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物。 將肌組織剪成碎塊，移入離心管中。p b s 液吹打漂洗3 次并靜置2 m i n ，離心后棄去上層液及漂 浮組織。加入0 0 2 5 9 m l 的i v 型膠原酶，3 7 消化5h 。離心后去上清液，j a a 0 2 5 t r y p s i n ， 3 7 孵育3 0 m i n ，血清中止消化離心后去上清液。生長(zhǎng)培養(yǎng)基( d m e m f 1 2 + 2 0 f b s + 1 青 鏈霉素) 重懸細(xì)胞，反復(fù)吹打后濾過2 0 0 目細(xì)胞篩網(wǎng)，收集濾液1 2 0 0 r p m 離心5m i n ，棄上清液，用 2 蚰生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸。 1 2 2 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的純化培養(yǎng) 采用p r e p l a t e 差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞純化，去除雜質(zhì)細(xì)胞的污染。將細(xì)胞接種子明膠包被 的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h ，貼壁細(xì)胞為p i p l ；未貼壁細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)1 2 h ，貼壁的細(xì)胞為p 1 p 2 ；未貼壁 細(xì)胞懸液再轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)2 4 h ，貼壁的細(xì)胞為p l p 3 ；未貼壁細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)2 4h ，貼壁的細(xì)胞為 p l p 4 ；再次將未貼壁的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)2 4 小時(shí)，貼壁的細(xì)胞為p 1 p 5 p l p 5 培養(yǎng)3 d 后換液，以 后隔天換液1 次，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長(zhǎng)至7 0 匯合度后傳代培養(yǎng)。 焦?jié)扇A 大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 明膠包被培養(yǎng)瓶：將0 1 的明膠l m l 加入到新的3 5 平皿中，放入3 7 度培養(yǎng)箱中，干 燥后使用。 1 2 3 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的冷凍 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)匯合度達(dá)到7 0 時(shí)，吸去原有培養(yǎng)液。用2 m l 次的p b s 清洗 細(xì)胞2 - - 3 次，使用胰蛋白酶溶液于3 7 。c ，3 m i n 消化收集細(xì)胞、加入等量d m e m f 1 2 + 2 0 f b s 培養(yǎng)液終止消化，以5 m l 移液器吹打使細(xì)胞充分懸浮。室溫下以1 ，2 0 0 r p m 離心5 m i n ，棄上 清液，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，加入細(xì)胞冷凍液后將細(xì)胞濃度調(diào)整為5 0 x 1 0 5 m l ，每個(gè)冷凍管中加 入l m l ，將細(xì)胞冷凍管在4 c 平衡3 0 m i n 、2 0 。c 中平衡2 h r ，然后放置8 0 c 冰箱過夜，2 4 小時(shí) 后投入1 9 6 液氮容器中保存。 1 2 4 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的解凍復(fù)蘇培養(yǎng) 從液氮容器中取出細(xì)胞凍存管，迅速投入3 7 。c 水浴中使細(xì)胞冷凍液融化。轉(zhuǎn)移細(xì)胞液至 1 5 m l 規(guī)格e p p e n d o r f 管中，室溫條件下1 , 2 0 0 r p m 離心5 m i n ，去上清。加入l m l 室溫下的 d m e m f 1 2 + 2 0 f b s 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再離心。如此反復(fù)清洗2 - - 3 次，最后將細(xì)胞懸液濃 度調(diào)整至1 0 1 0 5 m l 均勻地接種于6 0 m m 培養(yǎng)皿中，于3 7 。c 、5 c 0 2 、飽和濕度條件下培養(yǎng)， 2 4 h r 后換新鮮培養(yǎng)液以去除死細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞貼壁率。細(xì)胞生長(zhǎng)至大約7 0 匯合度時(shí)，傳代 擴(kuò)大培養(yǎng)。 1 2 5 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 選取p 4 p 5 ( 差速5 次后傳到第四代的細(xì)胞) ，以1 0 0 0 2 0 0 0 細(xì)胞孔密度接種9 6 孔板， 設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照和九個(gè)平行組。采用m t t 法，使用酶標(biāo)免疫分光光度計(jì)測(cè)量吸光度，計(jì)算 平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。其中第一次測(cè)得的數(shù)據(jù)記為2 4 h 。連續(xù)統(tǒng)計(jì)9 天。以細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù) 為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 注：每隔一天更換新鮮培養(yǎng)液。 1 2 6 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的成肌誘導(dǎo) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的衛(wèi)星細(xì)胞傳入新的培養(yǎng)皿后，待其匯合度長(zhǎng)到8 0 以后，開始成肌誘 導(dǎo)。成肌誘導(dǎo)的培養(yǎng)液為d m e m f 1 2 + 2 f b s 。 1 2 7 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的成脂誘導(dǎo) 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的衛(wèi)星細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到8 0 匯合度時(shí)，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)液 ( d m e m f 1 2 + 2 0 f b s + 1 u m 地塞米松+ l o u g m l 胰島素+ o 5 r a ml b m x + 2 0 0 u m 吲哚辛) 開始誘 導(dǎo)。期間每隔兩天換一次培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下每天觀察脂滴形成情況。待大部分細(xì)胞胞漿 內(nèi)出現(xiàn)脂滴時(shí)，4 多聚甲醛固定后油紅o 染色鑒定。 1 2 內(nèi)蒙占大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 8 馬血清對(duì)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的影響 、 將分離得到的細(xì)胞懸液直接使用含馬血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基( d m e m f 1 2 + 2 0 f b s + 1 0 馬 血清+ 1 青鏈霉素；或者d m e m f 1 2 + 2 0 馬血清+ 1 0 f b s + 1 青鏈霉素) 純化培養(yǎng)。至 p 1 p 5 后隔天換液，倒置顯微鏡下觀察。 2 肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定 2 1 細(xì)胞中d e s m i n 表達(dá)陽性細(xì)胞的檢測(cè) 選擇生長(zhǎng)良好的p 4 p 5 代細(xì)胞，用0 2 5 的胰酶消化液，3 7 。c 消化3m i n ，制成單細(xì)胞懸液， 調(diào)整細(xì)胞濃度為2 0 x 1 0 5 個(gè)m l ，接種于6 孔板，每孔內(nèi)預(yù)先放置1 塊明膠處理好的細(xì)胞玻璃爬 片。將接種好的培養(yǎng)皿放入3 7 。c 、5 c 0 2 、飽和濕度c 0 2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下， 每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取出細(xì)胞生長(zhǎng)良好，且細(xì)胞密度適中的細(xì)胞玻璃爬片，用4 多聚甲 醛固定3 0m i n 。之后參考s a b c 試劑盒說明進(jìn)行抗d e s m i n 免疫細(xì)胞化學(xué)染色，用d a b 顯色，主 要步驟為t 4 多聚甲醛固定細(xì)胞玻璃爬片3 0m i n ，p b s 緩沖液( p h 7 274 ) 洗5m i n x 3 次 上 p b s 新鮮配制的3 h 2 0 2 室溫孵育10m i n ，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性 l p b s 新鮮配制的5 的b s a 室溫孵育15m i n 土 不洗，滴加適當(dāng)稀釋的一抗，4 c 過夜 l p b s 緩沖液( p h7 2 7 4 ) 沖洗，5m i n x 3 次 l 滴加生物素標(biāo)記二抗( 羊抗鼠i g g ) ，3 7 。c 孵育2 0m i n j ， p b s 緩沖液( p h 7 274 ) 沖洗，5m i n x 3 次 上 ， 滴加試劑s a b c ，2 0 3 7 。c 孵育2 0m i n 焦?jié)扇A大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 | ， p b s 緩沖液( p h 7 274 ) 沖洗，5m i n x 4 次 l d a b 顯色：滴力i d a b 顯色液，鏡下觀察顯色程度，細(xì)胞內(nèi)有棕褐色物質(zhì)出現(xiàn)時(shí)， 蒸餾水終止顯色反應(yīng)。 2 2r t - p c r 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)m y f 5 和m y o d l 的表達(dá) 根據(jù)操作說明使用r n a i s or e a g e n t 試劑盒提取總r n a 。應(yīng)用p r i m e s c r i p t t mr t - p c rk i t 試劑盒，使用o l i g od t 作為反轉(zhuǎn)錄引物得到模板c d n a 。根據(jù)表中的引物及反應(yīng)條件擴(kuò)增目 的條帶并膠回收測(cè)序。 ( 1 ) 細(xì)胞總r n a 提取 消化6 孔板中的細(xì)胞，離心后每孔加1m lr n a i s or e a g e n t ，按廠商提供的說明書提取細(xì)胞總 r n a 。主要步驟如下： 消化6 孔板中的細(xì)胞，離心后每孔加lm lr n a i s or e a g e n t ， 用移液器反復(fù)吹打至無明顯沉淀，室溫靜置5m i n 上 向上述裂解液中加入1 5 體積的氯仿，蓋緊離心管蓋后渦旋震蕩， 待充分乳化后室溫靜置5m i n i 在高速冷凍離心機(jī)中4 c1 2 ，0 0 0 x g 離心1 5m i n ，樣品分為黃色有機(jī)相、 中間層和無色水相三層，r n a 主要在水相中，將水相轉(zhuǎn)移到新管中。 上 4 1 2 ，0 0 0 x g 離心1 0m i n ，棄上清液。離心后在管側(cè)和管底可見r n a 膠狀沉淀 上 加1m l7 5 乙醇( 用d e p c 處理水配制) 洗滌沉淀 土 4 。c 7 5 0 0 x g 離心5m i n ，棄上清液 l， 室溫放置晾干，按r n a 提取量的多少，加2 5 2 0 0 1 1 無r n a s e 的d e p c 處理水， 5 5 6 0 溶解后，一7 0 保存。 ( 2 ) 細(xì)胞總r n a 的檢測(cè) 1 4 內(nèi)蒙一i 大學(xué)碩士學(xué)位論文 提取的r n a 溶解在適量無r n a s e 的d e p c 水中。以5 0 0 倍d e p c 水稀釋，用紫外分光光度 計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)2 6 0 、2 8 0 處o d 值，計(jì)算o d 2 6 0 o d 2 8 0 值和r n a 濃度。提取的無污染、無降 解r n a o d 2 6 0 o d 2 8 0 值為1 8 2 0 。如有d n a 污染，用d n a s ei 處理。 ( 3 ) r t - p c r 反應(yīng)體系及操作按以下步驟進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄合成c d n a 第一條鏈 渦流混合器混合，在p t c 2 0 0 熱循環(huán)儀中7 0 。c 孵育5m i n ，冰上冷卻，短暫離心收集液滴； 在冰上按順序加入以下試劑 渦流混合器混合，短暫離心收集液滴，按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 3 0 1 0 m i n 4 2 1 2 9 5 4 2 0 m i n 5 m i n 2 4h r 合成的c d n a 在2 0 c 保存。 1 5 焦?jié)扇A大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 變性9 4 退火( 5 5 6 0 ) 延伸7 2 后延伸7 2 6 0s 4 5s 6 0s 1 0 m i n ( 4 ) p c r 引物 應(yīng)用蹦m e rp r e m i e r 5 0 軟件，按照引物設(shè)計(jì)的基本要求，設(shè)計(jì)肌肉衛(wèi)星細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄基 因m y f 5 和m y o d ，引物長(zhǎng)度1 8 - 2 2b p 。由寶生物合成。 m y f 5 ( n m0 0 1 1 0 6 7 8 3 ) m y o d l ( n m1 7 6 0 7 9 ) ( s e n s ep r i m e r ) 5 c a c a a c c a a c c c t a a c c a 3 ( a n t i - s e n s ep r i m e r ) 5 t g a t c c g a t c c a c t a t g c 3 ( s e n s ep r i m e r ) 5 g c t t g g g t t g a g c g a g a a 3 ( a n t i s e n s ep r i m e r ) 5 c c a a c a c c t g a g c g a a t g 3 5 5 9 8 7 25 2 0 c3 0 l7 3 1 9 0 85 4 。c3 5 ( 5 ) 電泳、凝膠成像 用0 5 x t b e 電泳緩沖液配制1 0 瓊脂糖凝膠，加熱溶解后倒板制膠，取p c r 擴(kuò)增產(chǎn)物 5 山與微量溴酚藍(lán)混合，上樣，同時(shí)加d n a 分子量l a d d e rm a r k e r ，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大 1 6 內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文 小。8 0 v 恒壓電泳，電泳完畢后用0 5 i ，t g m l 溴化乙錠染色5m i n ，在紫外透射儀下觀察結(jié)果， d o l p h i n - d o c 圖像分析系統(tǒng)拍照。 ( 6 ) p c r 產(chǎn)物的回收及純化 p c r 產(chǎn)物經(jīng)1 0 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在預(yù)知大小區(qū)檢查p c r 產(chǎn)物條帶，切膠回收、 并以瓊脂糖凝膠d n a 回收試劑盒( d p 2 0 9 0 2 離心柱型) 純化備用。 ( 7 ) 回收產(chǎn)物序列的測(cè)定 測(cè)序工作委托寶生物工程( 大連) 有限公司( t a k a r a ) ，應(yīng)用a b ip r i s m v s 4 3 7 3 0 x 1 型d n a 自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行。 3 大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的外源基因轉(zhuǎn)染 3 1f a t 1 表達(dá)載體的構(gòu)建 所使用的f a t 1 特異性表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室段彪提供。擴(kuò)大培養(yǎng)含有f a t - i 特異性表達(dá)載 體pi e - b f a t l 質(zhì)粒的e c o l id h 5 a 宿主菌，按照去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒的說明和要求 提取和純化兩種待轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒。以紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度和純度。 3 2 大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 3 2 1 脂質(zhì)體l i p 0 2 0 0 0 介導(dǎo)f a t 1 轉(zhuǎn)染大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞 參, , 昭, , l i p 0 2 0 0 0 操作說明和要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前一日，胰蛋白酶消化大鼠肌肉衛(wèi)星 細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。離心去上清，以無抗生素d m e m f 1 2 + 1 0 f b s 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按 照2 - - 一3 x1 0 5 細(xì)胞孔密度接種六孔培養(yǎng)板。 轉(zhuǎn)染當(dāng)日，以移液器分別量取6 p 1 約合4 0 1 i g 質(zhì)粒至4 個(gè)1 5 m l 規(guī)格e p p e n d o r 借中，用無血清 d m e m f 1 2 調(diào)整至終體積為2 5 0 9 l ，室溫放置1 0 m i n ，將質(zhì)粒和脂質(zhì)體對(duì)應(yīng)輕輕混勻，室溫下 靜置2 0 m i n ，吸棄細(xì)胞原上清液后將混合物加入六孔培養(yǎng)板中、前后搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻，在3 7 c 、 5 c 0 2 、飽和濕度條件下培養(yǎng)，6 h r 后續(xù)加5 0 0 ld m e m f 12 繼續(xù)培養(yǎng)至4 8 h r 。 3 3 轉(zhuǎn)f a t 1 大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的篩選 3 3 1 大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞g 4 1 8 敏感度測(cè)定 將p 4 p 5 代大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞以1 x 1 0 5 細(xì)胞孔密度接種在2 個(gè)六孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至 7 0 匯合度時(shí)，在1 0 孔細(xì)胞中依次加入g 4 1 8 ( 5 0 m g m 1 ) ，使其在培養(yǎng)液中的終濃度分別為 1 7 焦?jié)扇A大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 10 0 9 9 m l ，2 0 0 9 9 m l 、3 0 0 9 9 m l ，4 0 0 9 9 m l ，5 0 0 9 9 m l ，6 0 0 j t g m l ，7 0 0 1 a g m l ，8 0 0 9 9 m l ，9 0 0 9 9 m l 和1 0 0 0 9 9 m l ，每種濃度接種1 孔細(xì)胞，連續(xù)培養(yǎng)1 5 天，保持每3 天換液一次，記錄和觀察 在g 4 1 8 不同濃度下細(xì)胞被全部殺死的天數(shù)，掌握大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)g 4 1 8 敏感度的大致規(guī) 律，以5 7 d 內(nèi)殺死全部細(xì)胞的最低濃度作為篩選時(shí)的最佳濃度。 3 3 2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆的體外篩選和擴(kuò)大培養(yǎng) 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞經(jīng)4 8 h r 后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)染率，胰蛋白酶重新消化細(xì)胞，以2 x 1 0 4 細(xì)胞孔密度接種在 1 0 0 m m 培養(yǎng)皿中，2 4 h r 待細(xì)胞貼壁后更換新鮮的、d m e m f 1 2 + 2 0 f b s 培養(yǎng)液，按照確定 的最佳篩選濃度加入g 4 1 8 ，每3 天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)1 0 天后，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中形成的、同 時(shí)具有新霉素抗性和綠色熒光的單克隆細(xì)胞群。 在熒光顯微鏡和相差顯微鏡下，觀察綠色熒光表達(dá)強(qiáng)烈而且克隆細(xì)胞簇均一的細(xì)胞克隆， 在培養(yǎng)皿底相應(yīng)位置以記號(hào)筆畫圈標(biāo)示。超凈臺(tái)中吸去原有培養(yǎng)液，以p b s 清洗細(xì)胞3 次， 加入5 m l 新鮮d m e m f 1 2 + 1 0 f b s 培養(yǎng)液。以無菌一次性2 0 0 9 l 移液器槍頭先沿著標(biāo)示圈 邊緣劃割單克隆細(xì)胞群，然后在圈內(nèi)逐行刮取細(xì)胞，并不斷吸取培養(yǎng)皿內(nèi)少許培養(yǎng)液沖刷標(biāo) 示圓圈。待全部刮取完畢，收集全部5 m l 含細(xì)胞的培養(yǎng)液至1 5 m l 離心管，新加入5 m l 培養(yǎng) 液再次沖洗培養(yǎng)皿后收集培養(yǎng)液，1 , 5 0 0 r p m 離心5 m i n ，去上清后使用胰蛋白酶溶液于3 7 c ， 1 m i n 消化細(xì)胞、使細(xì)胞群在酶解作用下充分分散，加入等量d m e m f 1 2 + 1 0 f b s 培養(yǎng)液終 止消化。再次離心去掉上清液、細(xì)胞沉淀重新調(diào)整濃度后在含g 4 1 8 培養(yǎng)液內(nèi)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。 4 結(jié)果 4 1 形態(tài)學(xué)觀察 p l p 5 ( 差速貼壁四次后的細(xì)胞懸液) 2 4 小時(shí)后開始貼壁，部分細(xì)胞伸出小的突起。4 8 小時(shí)后，絕大多數(shù)細(xì)胞形成梭形單核細(xì)胞，胞漿豐富，細(xì)胞折光度高。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)， 細(xì)胞的梭形形狀更為明顯，細(xì)胞間開始拉網(wǎng)，細(xì)胞通訊更為頻繁。1 0 8 小時(shí)后，匯合度達(dá)到 7 0 。待細(xì)胞匯合度達(dá)到7 0 以上時(shí)開始傳代。 1 8 內(nèi)蒙古人學(xué)碩i j 學(xué)化論文 f i g 1 t h em o r p h o l o g yo f t h eg r o w i n ga n dd i f f e r e n t i o no ft h ec u l t u r e dr a ts a t e l l i t ec e l l s f i g 1 細(xì)胞生長(zhǎng)圖片 a ：培養(yǎng)4 8 小時(shí)b ：培養(yǎng)7 2 小時(shí)；c ：培養(yǎng)1 0 8 小時(shí)；d ：成肌誘導(dǎo) a ，ba n dc - s a t e l l i t ec e l l sc u l t u r e df o r4 8 h ，7 2 h ，a n d1 0 8 h ，r e s p e c t i v e l y d ：m y o t u b ef o r m a t i o ni n d u c e df r o mt h e s a t e l l i t ec e l l s 4 2 生長(zhǎng)曲線 穩(wěn)定的細(xì)胞系經(jīng)過4 8 小時(shí)后開始增殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期維持8 天，此后進(jìn)入平臺(tái)期。 此時(shí)匯合度在8 0 以上，應(yīng)該進(jìn)行傳代( 如圖f i g 2 ) 。 1 9 愛意 一 一 一 聲 “ 一 o _ p ， _ q ， 露譬麓易驢薌蠡譬e-b髟一多一努緩rr k 焦 幣華大鼠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定與誘導(dǎo)分化 f i g 2 t h eg r o w t hc u r v eo f t h es a t e l l i t ec e l l s 圖2 衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 4 3 細(xì)胞中d e s m i n 表達(dá)陽性細(xì)胞的檢測(cè) 如圖3 所示，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示分離得到的細(xì)胞系高表達(dá)d e s m i n ，證明這些細(xì)胞具 有肌源性( f i g 3 ) 。 f i g 3 1 e x p r e s s i o no f d e s m i ni nt h ec u l t u r e dc e l l sp r e s e n t e di m m u o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n g f i g 3 - 1 結(jié)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色 4 4 r t - p