核酸的生產(chǎn)ppt課件.ppt

核酸的生產(chǎn),1,什么是核酸？,welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience,由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸，簡稱RNA和脫氧核糖核酸，簡稱DNA。,2,一、核酸藥物的分類,（一）具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì),如：DNA、RNA、肌苷、ATP、輔酶A、脫氧核苷酸、肌苷酸等。獲得：微生物發(fā)酵或從生物資源中提取生產(chǎn)。藥理功能：有助于改善機體的物質(zhì)代謝和能量代謝平衡，加速受損組織的修復(fù)，促使機體恢復(fù)正常生理功能。著名企業(yè)：珍奧集團、GENTA公司,3,（二）天然堿基、核苷、核苷酸的類似物或聚合物,如：三氟代胸苷、疊氮胸苷、拉米夫定（嘧啶類）、阿德福韋（嘌呤類）、恩替卡韋（第三代核苷類抗乙肝病毒藥物）等。獲得：由自然結(jié)構(gòu)的核酸類物質(zhì)通過半合成生產(chǎn)。藥理功能：治療病毒病如乙肝、腫瘤、愛滋病的重要藥物，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制劑的臨床藥物。,4,二、核酸類藥物的生產(chǎn)方法,welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience,除病毒外，所有的動植物組織中都含有核酸類物質(zhì)，包括大分子DNA和RNA、小分子的核苷酸、核苷、堿基等成分，但不同的組織中含量有所不同。動物胸腺中DNA含量較多，是提取DNA的原料；酵母細(xì)胞中RNA含量最多，是提取生產(chǎn)RNA的主要原料。,5,（二）DNA和RNA的生產(chǎn)方法,1、分離提取,核酸的生產(chǎn)一般采用提取法，即從粉碎、破裂的生物組織細(xì)胞中通過一定的方法獲取總DNA或總RNA。如需進一步的純化，常用純化方法如柱層析、凝膠電泳和密度梯度超離心。,、人工合成,獲取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化學(xué)的方法按照設(shè)定的核苷酸順序逐一加入形成核酸?，F(xiàn)已有核酸合成儀，但合成長度還有一定限制，并且該儀器價格昂貴。因此這種方法一般用于研究，不適合生產(chǎn)。,6,（三）核苷酸、核苷及堿基類似物的生產(chǎn)方法,1、酶解法生產(chǎn)酵母，從酵母中提取RNA，RNA經(jīng)青霉菌屬或鏈霉菌屬等微生物產(chǎn)生的酶進行酶解，制成各種核苷酸。,2、半合成法微生物發(fā)酵與化學(xué)合成并用。,3、直接發(fā)酵法采用營養(yǎng)缺陷型菌株或營養(yǎng)缺陷型兼結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株來發(fā)酵大量生產(chǎn)目的核苷或核苷酸。,7,二、核酸類藥物的生產(chǎn)方法,1.直接提取法,2.水解法（酶水解、堿水解、酸水解）,3.化學(xué)合成法,4.酶合成法,8,二、核酸類藥物的生產(chǎn)方法,5.微生物發(fā)酵法,9,（一）DNA的生產(chǎn)技術(shù),1、提取原理,在細(xì)胞內(nèi)的核酸通常是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物核糖核蛋白（RNP）和脫氧核糖核蛋白（DNP），這兩種復(fù)合物在不同電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。RNApro.RNP（核糖核蛋白）DNApro.DNP（脫氧核糖核蛋白）00.14MNaCl溶液，DNP溶解度，RNP的溶解度；0.14M0.5MNaCl溶液，DNP溶解度，RNP的溶解度。在制備DNA時，可利用0.14MNaCl溶液使DNP與RNP分開。由于DNP在濃鹽溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用濃鹽溶液（12M）盡量抽提DNP，然后再去除雜蛋白。,10,2、工藝路線,11,DNA的粗提取,1、準(zhǔn)備材料將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室,至少24h。,2、取材稱取30g菜花，去梗取花,切碎。,3、研磨將碎菜花放入研缽中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。,12,DNA的粗提取,4、過濾在漏斗中墊上尼龍紗布，將菜花研磨液倒入塑料離心管中進行離心,用1000r/min的旋轉(zhuǎn)頻率，離心25min，取上清液放入燒杯中，取上清液。,5、加冷酒精將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液中，并用玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液，可見白色的DNA絮狀物出現(xiàn)。,13,DNA的鑒定,1、配制二苯胺試劑取0.1mLB液，滴入到10mLA液中，混勻。,2、鑒定取4mLDNA提取液放入試管中，加入4mL二苯胺試劑，混勻后觀察溶液顏色(不變藍(lán))。用沸水浴(100)加熱10min。在加熱過程中，隨時注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現(xiàn)淺藍(lán)色)。,14,（二）RNA的生產(chǎn),1、來源,微生物酵母通常在細(xì)菌中RNA占525，在啤酒酵母中占2.715，在霉菌中占0.728%，面包酵母含RNA4.17.2。酵母菌體提取優(yōu)點：（1）收率高；（2）提取容易。,15,、RNA的提取等電沉淀法,16,3、工藝過程,welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience,（1）預(yù)處理：壓榨、除水；（2）提?。?.13%NaOH，使細(xì)胞壁變性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來；（3）中和、除菌體；（4）分離：等電點法，調(diào)pH2.5，使RNA沉淀下來；（5）洗滌、干燥：95%乙醇,17,檢測,2、RNA含量測定,（1）定磷法660nm；（2）定糖法地衣二酚（苔黑酚）法。鹽酸