單元三：遺傳物質(zhì)的分子基礎.ppt

單元三、遺傳物質(zhì)的分子基礎,本單元重點1核酸的化學結(jié)構(gòu)（DNA、RNA）；2原核生物和真核生物染色體的分子結(jié)構(gòu)；3DNA的半保留復制和特點；4三種RNA分子的合成、轉(zhuǎn)錄及加工；5遺傳密碼與蛋白質(zhì)翻譯。,3-1核酸的分子組成及結(jié)構(gòu)3-2基因的表達3-3基因工程,3-1核酸的分子組成及結(jié)構(gòu)一、核酸的分子組成及結(jié)構(gòu)(一)兩種核酸及其分布：1.核酸：以核苷酸為單元構(gòu)成的多聚體，是一種高分子化合物。五碳糖：脫氧核糖、核糖核苷酸磷酸鳥嘌呤G、腺嘌呤A環(huán)狀的含氮堿基胞嘧啶C、胸腺嘧啶T或尿嘧啶U,核酸有兩種：脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。兩種核酸的主要區(qū)別如下：,DNA通常是雙鏈一般較長。RNA主要為單鏈，分子鏈較短。,圖構(gòu)成核苷酸分子的堿基和核糖,DNA核苷酸,五碳糖：脫氧核糖堿基：A、T、C、G,RNA核苷酸,五碳糖：核糖堿基：A、U、C、G,DNA四種脫氧核苷酸,DNA分子,2分布：高等植物：DNA存在于染色體，葉綠體、線粒體中；RNA在核（核仁、染色體）、細胞質(zhì)中。細菌：DNA和RNA。噬菌體：多數(shù)只有DNA。植物病毒：多數(shù)只有RNA。動物病毒：有些含RNA、有些含DNA。,(二)DNA的分子結(jié)構(gòu)：1.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)：1953年，沃森（WatsonJ.D.）和克里克（CrickF.H.C.）提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。主要依據(jù)為：堿基互補配對的規(guī)律以及DNA分子的X射線衍射結(jié)果。沃森和克里克與維爾肯斯(Wilkins)一起獲得諾貝爾獎(1962)。,雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)(1953),模型建立者:JamesWATSON:生物學家FrancisCRICK:化學家雙螺旋模型實驗數(shù)據(jù)的重要貢獻者：RosalindFRANKLIN:KingsCollageLondon的MRC生物物理單位物理化學家，首先將磷酸原子定位于DNA外表面并發(fā)現(xiàn)了“B”型DNAMauriceWILKINS:“A”型DNA的發(fā)現(xiàn)者,電子顯微鏡下的人類DNA,特點：(1)兩條互補多核酸鏈、在同一軸上互相盤旋；(2)雙鏈具有反向平行的特點；(3)堿基配對原則為：A=T、G=C，雙螺旋直徑約20A，螺距為34A(10個堿基對)。,遺傳信息載體：脫氧核糖核酸（DNA）雙螺旋分子；長度單位：堿基對(bp)，千堿基對(Kb)，百萬堿基對(Mb),(4)A-T、G-C排列方法有以下四種：A-TG-CG-CA-TC-GA-TA-TC-G設某一段DNA分子鏈有1000對堿基,則有41000種不同排列組合，就可能有41000種不同性質(zhì)的基因。,(5)物種：同物種中的DNA的堿基含量不同：a.DNA分子上的堿基順序是一致的，一般保持不變才能保持該物種的遺傳特性的穩(wěn)定；b在特殊條件下，堿基順序改變，出現(xiàn)遺傳變異。,2.DNA構(gòu)型：B-DNA：生理狀態(tài)下，每螺圈10.4個堿基對，右手螺旋；A-DNA：高鹽濃度下，每螺圈11個堿基對，右手螺旋；Z-DNA：序列富含GC，嘌呤和嘧啶交替出現(xiàn)，每螺圈12個堿基對，左手螺旋。,(三)RNA分子結(jié)構(gòu)：U代替T；與DNA的區(qū)別核糖代替脫氧核糖；一般以單鏈存在。,(四)DNA的復制1.DNA復制的一般特點：(1)半保留復制：瓦特森(WatsonJ.D.)等提出的DNA半保留復制方式。其方法為：a.一端沿氫鍵逐漸斷開；b.以單鏈為模板，堿基互補；c.氫鍵結(jié)合，聚合酶等連接；d.形成新的互補鏈；e.形成了兩個新DNA分子。DNA的這種復制方式對保持生物遺傳的穩(wěn)定性是非常重要的。,(2)復制起點和復制方向：真核生物每條染色體的DNA復制都是多起點，多個復制起點共同控制整個染色體的復制；每條染色體有多個復制子；且為雙向復制；,2.DNA復制過程1）DNA雙螺旋的解鏈*DNA解旋酶在ATP供能下，每分鐘旋轉(zhuǎn)3000次解開雙螺旋；*單鏈DNA結(jié)合蛋白馬上結(jié)合在分開的單鏈上，以避免產(chǎn)生單鏈內(nèi)配對；*DNA拓撲異構(gòu)酶來解決由于復制叉的推進而產(chǎn)生超螺旋的問題。,2）DNA合成的開始合成DNA片段之前，先由RNA聚合酶合成一小段RNA引物(約有20個堿基對)DNA聚合酶才開始起作用合成DNA片段。,3）后隨鏈的不連續(xù)復制DNA聚合酶，以53方向發(fā)揮作用；從35合成方向的一條鏈，就會遇到困難?？级鞑?KornbergA.,1967)提出不連續(xù)復制假說：在35方向鏈上，仍按從53的方向一段段地合成DNA單鏈小片段“岡崎片段”(10002000bp)由連接酶連接這些片段形成一條連續(xù)的單鏈。,Helicase:解旋酶primosme,復制叉結(jié)構(gòu):,圖DNA合成模型,32基因的表達,基因作為遺傳信息單位，位于染色體上，控制生物的性狀發(fā)育。DNA是攜帶生物遺傳信息的載體，是遺傳的分子基礎?；虮磉_就是將基因攜帶的生物信息釋放出來，供細胞利用的過程，或?qū)⑸锏倪z傳信息作為性狀或特征表現(xiàn)出來的過程。通常所說的基因表達指基因指導蛋白質(zhì)合成的過程。原核生物或真核生物為了適應外界環(huán)境條件及自身的需要，都必須不斷調(diào)控各種不同基因的表達方式。,一、基因的概念及其發(fā)展：、經(jīng)典遺傳關于基因的概念：孟德爾：把控制性狀的因子稱為遺傳因子。如：豌豆紅花(C)、白花(c)、植株高(H)、矮(h)。約翰生：提出基因(gene)這個名詞，取代遺傳因子。摩爾根：對果蠅、玉米等的大量遺傳研究，建立了以基因和染色體為主體的經(jīng)典遺傳學?；蚴腔瘜W實體，以念珠狀直線排列在染色體上。,基因的共性（按照經(jīng)典遺傳學對基因的概念）：染色體特性：自我復制能力和相對穩(wěn)定性，在分裂時有規(guī)律地進行分配。交換單位：基因間能進重組，而且是交換的最小單位。突變單位：一個基因能突變?yōu)榱硪粋€基因。功能單位：控制有機體的性狀。經(jīng)典遺傳學認為：基因是一個最小的單位，不能分割；既是結(jié)構(gòu)單位，又是功能單位。,分子遺傳學關于基因的概念：,揭示遺傳密碼的秘密：基因具體物質(zhì)。具體內(nèi)容：一個基因DNA分子上一定區(qū)段，攜帶有特殊的遺傳信息轉(zhuǎn)錄成RNA(包括mRNA、tRNA、rRNA)或?qū)ζ渌虻幕顒悠鹫{(diào)控作用(如調(diào)節(jié)基因、啟動基因、操縱基因)。基因不是最小遺傳單位更復雜的遺傳和變異單位：例如：在一個基因區(qū)域內(nèi)，仍可以劃分出若干起作用的小單位。,現(xiàn)代遺傳學上認為：突變子：指性狀突變時產(chǎn)生突變的最小單位，一個突變子可以小到一個核苷酸對。如移碼突變。重組子：指發(fā)生性狀重組時，產(chǎn)生重組的最小單位，可小到只包含一個核苷酸對。順反子：就是一個基因，是一個完整的不可分割的功能單位。包括與一個多肽鏈的合成相對應的一段DNA，平均大小為5001500bp,可有若干交換子和突變子。,基因概念：可轉(zhuǎn)錄一條完整的RNA分子或編碼一個多肽鏈；功能上被順反測驗或互補測驗所規(guī)定。分子遺傳學保留了功能單位的解釋，而拋棄了最小結(jié)構(gòu)單位說法?；颍合喈斢谝粋€順反子，包含許多突變子和重組子。,紫外燈下的DNA,二、遺傳密碼：密碼子與氨基酸DNA分子堿基只有4種，而蛋白質(zhì)氨基酸有20種。堿基與氨基酸之間不可能一一對應。141=4種：缺16種氨基酸；242=16種：比現(xiàn)存的20種氨基酸還缺4種；343=64種：由三個堿基一起組成的密碼子能夠形成64種組合，20種氨基酸多出44種。簡并：一個氨基酸由二個或二個以上的三聯(lián)體密碼所決定的現(xiàn)象。三聯(lián)體或密碼子：代表一個氨基酸的三個一組的核苷酸。,遺傳密碼字典每一個三聯(lián)體密碼所翻譯的氨基酸是什么呢?從1961年開始，在大量試驗的基礎上，分別利用64個已知三聯(lián)體密碼，找到了相對應的氨基酸。19661967年，完成了全部遺傳密碼表，如UGG為色氨酸。,遺傳密碼字典,遺傳密碼的基本特征：1遺傳密碼為三聯(lián)體：三個堿基決定一種氨基酸；61個為有意密碼，起始密碼為GUG、AUG(甲硫氨酸)；3個為無意密碼，UAA、UAG、UGA為蛋白質(zhì)合成終止信號。2.遺傳密碼間不能重復:在一個mRNA上每個堿基只屬于一個密碼子；均以3個一組形成氨基酸密碼。,3.遺傳密碼間無逗號：AUGGUACUGUCA甲硫氨酸纈氨酸亮氨酸絲氨酸密碼子與密碼子之間無逗號，按三個三個的順序一直閱讀下去，不漏讀不重復。如果中間某個堿基增加或缺失后，閱讀就會按新的順序進行下去，最終形成的多肽鏈就與原先的完全不一樣(稱為移碼突變)。AUG（G）UACUGUCA甲硫氨酸酪氨酸半胱氨酸,4簡并性：簡并現(xiàn)象：色氨酸(UGG)和甲硫氨酸(AUG)例外，僅一個三聯(lián)體密碼；其余氨基酸都有一種以上的密碼子。61個為有意密碼，起始密碼為GUG、AUG(甲硫氨酸)。3個為無意密碼，UAA、UAG、UGA為蛋白質(zhì)合成終止信號。簡并現(xiàn)象的意義：同義的密碼子越多，生物遺傳的穩(wěn)定性也越大。如：UCU、UCC或UCA或UCG，均為絲氨酸。,5遺傳密碼的有序性：決定同一個氨基酸或性質(zhì)相近的不同氨基酸的多個密碼子中，第1個和第2個堿基的重要性大于第3個堿基，往往只是最后一個堿基發(fā)生變化。例如：脯氨酸（pro）：CCU、CCA、CCC、CCG。,6通用性：在整個生物界中，從病毒到人類，遺傳密碼通用。4個基本堿基符號所有氨基酸所有蛋白質(zhì)生物種類、生物體性狀。1980年以后發(fā)現(xiàn)：具有自我復制能力的線粒體tRNA(轉(zhuǎn)移核糖核酸)在閱讀個別密碼子時有不同的翻譯方式。如：酵母、鏈孢霉與哺乳動物的線粒體。,三、蛋白質(zhì)的合成DNA對性狀的控制作用并不是直接的，遺傳密碼到蛋白質(zhì)的合成過程包括遺傳密碼的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個步驟。轉(zhuǎn)錄：就是以DNA雙鏈之一的遺傳密碼為模板，把遺傳密碼以互補的方式轉(zhuǎn)錄到mRNA（信使核糖核酸）上。,翻譯：就是mRNA攜帶著轉(zhuǎn)錄的遺傳密碼，附著在核糖體上，把tRNA（轉(zhuǎn)移核糖核酸）運來的各種氨基酸，按照mRNA的密碼順序，相互連接起來成為多肽鏈，并進一步折疊起來成為立體蛋白質(zhì)分子。,（一）RNA的轉(zhuǎn)錄與RNA的種類1.RNA的種類（1）信使RNA(messengerRNA，mRNA)（2）轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA，tRNA)（3）核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)三種不同的RNA分子在基因的表達過程中起重要的作用。,（1）信使RNA(mRNA)：mRNA的功能就是把DNA上的遺傳信息精確無誤地轉(zhuǎn)錄下來，然后，由mRNA的堿基順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序，是基因表達過程中遺傳信息傳遞的中介。它起著傳遞信息的作用，因而稱為信使RNA(mRNA)。,（2）轉(zhuǎn)移RNA（tRNA)如果說mRNA是合成蛋白質(zhì)的藍圖，則核糖體是合成蛋白質(zhì)的工廠。由于合成蛋白質(zhì)的原材料20種氨基酸與mRNA的堿基之間缺乏特殊的親和力。因此，必須用一種特殊的RNA轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)把氨基酸搬運到核糖體上，能根據(jù)mRNA的遺傳密碼依次準確地將它攜帶的氨基酸連結(jié)成多肽鏈。每種氨基酸可與14種tRNA相結(jié)合，現(xiàn)在已知的tRNA的種類在40種以上。,1969年以來，研究了來自各種不同生物，如：酵母、大腸桿菌、小麥、鼠等的十幾種tRNA的結(jié)構(gòu)，證明它們的堿基序列都能折疊成三葉草葉型(圖)。,tRNA是最小的RNA。其分子量約為27000(2500030000)，由70到90個核苷酸組成。,tRNA的結(jié)構(gòu)的共性(圖323)：,5端之末具有G(大部分)或C。3端之末都以ACC的順序終結(jié)。有一個富有鳥嘌呤的環(huán)。有一個反密碼子環(huán)，其的頂端有三個暴露的堿基，稱為反密碼子。這一個反密碼子可以與mRNA鏈上同自己互補的密碼子配對。有一個胸腺嘧啶環(huán)。,(3)核糖體RNA（rRNA）核糖體RNA，它是組成核糖體的主要成分，而核糖體則是合成蛋白質(zhì)的中心。原核生物的核糖體所含的rRNA，有5S、16S及23S等三種真核生物的核糖體，含有4種rRNA和約80種蛋白質(zhì)。四種rRNA為5S、5.8S、18S和28S。S為沉降系數(shù)(sedimentationcoefficient)，當用超速離心測定一個粒子的沉淀速度時，此速度與粒子的大小直接成比例。,rRNA是單鏈，它包含不等量的A與U、G與C，但是有廣泛的雙鏈區(qū)域。在雙鏈區(qū)，堿基因氫鍵相連，表現(xiàn)為發(fā)夾式螺旋。rRNA在蛋白質(zhì)合成中的功能尚未完全明了。但16S的rRNA3端有一段核苷酸序列與mRNA的前導序列是互補的，這可能有助于mRNA與核糖體的結(jié)合。,核糖體：蛋白質(zhì)翻譯的場所,2.RNA的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄,ATGCCGGTACGGGCAAATATGCCCATGCTACGGCCATGCCCGTTTATACGGGTACG,轉(zhuǎn)錄因子,以一條DNA鏈為模板合成RNA尿嘧啶（U）取代了胸腺嘧啶（T）,首先是以DNA的一條鏈為模板合成與它互補的mRNA，根據(jù)堿基互補配對的規(guī)律，在這條mRNA鏈上，A變?yōu)閁，T變?yōu)锳，C變?yōu)镚，G變?yōu)镃。因此，這條mRNA上的遺傳密碼與非模板DNA鏈是一樣的，所不同的只是U代替了T。然后再由mRNA上的遺傳密碼翻譯成多肽鏈中的氨基酸序列。,（四）蛋白質(zhì)的合成過程蛋白質(zhì)是由20種不同的氨基酸組成的多肽鏈，每種蛋白質(zhì)都有其特定的氨基酸序列。遺傳信息貯存于DNA里，由DNA所含的堿基序列決定氨基酸序列的過程即蛋白質(zhì)的合成過程，也就是基因的表達過程，實際上包括遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個步驟。,蛋白質(zhì)的合成，也就是遺傳信息的翻譯過程。翻譯就是mRNA攜帶著轉(zhuǎn)錄的遺傳密碼附著在核糖體(ribosome)上，把由tRNA運來的各種氨基酸，按照mRNA的密碼順序，相互聯(lián)結(jié)起來成為多肽鏈，并進一步折疊成為立體的蛋白質(zhì)分子的過程。,蛋白質(zhì)合成的過程概述：在核內(nèi)以DNA的一條鏈作為模板合成的不均DNA穿過核膜孔，進入細胞質(zhì)后被酶切割成mRNA。然后核糖體的大小兩個亞單位在起始密碼子AUG部位結(jié)合成一個核糖體，細胞質(zhì)中的tRNA在激活酶和ATP的作用下，攜帶各自的氨基酸進入核糖體。最先進入的是攜帶甲硫氨酸的tRNA。因為它的反密碼子UAI和mRNA的密碼子AUG是對應的。同時第二個進入的攜帶有蘇氨酸的tRNA，在核糖體中甲硫氨酸和蘇氨酸結(jié)合，第一個tRNA釋放，核糖體向右移動一個密碼子距離，第三個進入的是攜帶有亮氨酸的tRNA，之后亮氨酸和蘇氨酸相結(jié)合，第二個tRNA釋放。核糖體又向右移動一個密碼子距離以此類推。,當一個核糖體在mRNA上移動時，氨基酸就一個個地結(jié)合起來形成肽鏈。最后這個核糖體在mRNA的停止信號處脫落下來，分解為大小兩個亞單位。把合成的肽鏈釋放到胞質(zhì)中，以后幾個肽鏈結(jié)合起來折疊，形成一個具有空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，而且具有一定的生物學的功能。必須指出：在mRNA上，同時有許多的核糖體結(jié)合上去進行著蛋白質(zhì)的合成，當?shù)谝粋€核糖體沿著mRNA的53方向移動后，第二個核糖體又結(jié)合到mRNA上，以后第三個、第四個順序結(jié)合上去，這樣一串念珠就構(gòu)成了多核糖體。一個多核糖體的核糖體數(shù)目的多少和要讀出的mRNA長度有關，讀出的信息越長，用于翻譯的核糖體數(shù)越多。一般5-40個，每個成員距離為50-100A。從而可見蛋白質(zhì)的合成過程即是遺傳密碼的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程。,翻譯是指：mRNA攜帶著轉(zhuǎn)錄來的遺傳密碼附著在核糖體上，把由轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA）運來的各種氨基酸按著mRNA的密碼順序，相互連接起來成為多肽鏈，并進一步的疊起來成為立體蛋白質(zhì)分子。蛋白的合成過程是mRNA，tRNA、rRNA和核糖體協(xié)同作用的結(jié)果。,圖蛋白質(zhì)合成的起始,圖蛋白質(zhì)合成的肽鏈延伸,圖蛋白質(zhì)合成的終止,DNARNAPROTEIN表型代謝問題中心法則生長、分化個體發(fā)育表型變異,中心法則,四、中心法則及其發(fā)展,修改后的中心法則,反轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄)：反轉(zhuǎn)錄酶；cDNA。RNA的自我復制。DNA指導蛋白質(zhì)合成,五、基因的作用與性狀表達,由于大部分遺傳性狀的表現(xiàn)都是在直接或間接的通過蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來的，因此深入的揭示Gene在這方面的作用對于了解Gene的在性狀形成過程中的作用將是更有意義的事情，gene對遺傳性狀的表現(xiàn)作用可以分為以下兩種：,1直接作用如果gene能直接的影響到形成某種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)gene的作用，那么gene的變異可以直接的影響蛋白質(zhì)的特性，從而表現(xiàn)出不同的性狀來，,例如人類鐮形細胞貧血癥，可以作為這方面的實例，正常人的紅細胞是圓形，患有此病的人的紅細胞呈鐮刀形，這是由于一個正常gene所產(chǎn)生的兩個不同的突變體所引起的，即由：HbAHbs，HbAHbC，從而引起此病，HbA,HbS,HbC三個gene所決定的血紅蛋白區(qū)別在于鏈中第六位上有一個氨基酸的不同：具體情況如下：鏈上的氨基酸的號1236146正常的血紅蛋白的氨基酸纈組亮谷,正常氨基酸的密碼GAAHbS氨基酸的密碼GUA（纈）HbC氨基酸的密碼AAA（賴）每個血紅蛋白分子具有4條鏈，鏈具有2條，每條具有141個氨基酸，鏈具有2條，每條有146個氨基酸，可見決定谷氨酸上mRNA的密碼GAA改變成GUA只是第2個堿基由AU，從而基因由HbAHbS，同理由GAA改寫為AAA只是第一個堿基發(fā)生變化，從而gene由HbAHbC，可見只要gene中的一個堿基發(fā)生變化，就能引起最后產(chǎn)物血紅蛋白性狀的變化，從而導致患病，以上關于異常血紅蛋白的產(chǎn)生，表明gene控制肽鏈的形成，因此一個gene一個多肽鏈的假說是有事實依據(jù)的，這是gene對性狀表現(xiàn)的直接作用。,HbA,突變,HbsHbc,鐮刀形紅血球,紅血球碟形,2間接作用生物的性狀是由gene控制的，但gene不等于遺傳性狀，從基因到表現(xiàn)型要經(jīng)過一系列發(fā)育過程，任何性狀都是gene控制下通過一系列發(fā)育過程才能形成的，也就是說必須經(jīng)過一系列的代謝過程，每一個代謝過程必須有酶的催化，而酶又是一種特殊的蛋白質(zhì)，它的合成是受gene控制的，絕大多數(shù)情況下gene都是通過酶的合成間接的影響性狀表現(xiàn)的，例如有一種飼料作物白三葉草的某些品種的葉含有氰酸（HCN）易使牲畜中毒，據(jù)分析表明，氰酸的產(chǎn)生是受l和H兩個顯性gene的互作來控制的，H、lgene分別來控制兩種酶的合成，因而控制兩種物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，以致最后控制氰酸的合成。,研究表明只有兩個gene都為顯性狀時才能通過酶的作用而順利的合成氰酸，如果其中有一個或兩個基因都為隱性時，即iiHH、IIhh、iihh引起有關的酶喪失作用，引起代謝過程的中斷，不能合成氰酸，不會表現(xiàn)中毒的性狀，依據(jù)許多的類似的實驗，有人提出“一個gene一個酶的假說”，一個gene控制一種酶，同時又進一步的控制一個生化過程，從而影響到某一物質(zhì)的合成，而導致某一遺傳性狀的表現(xiàn)。從現(xiàn)代的觀點來看，一個gene一個酶的假說過于簡單化，因為一種酶和一種蛋白質(zhì)可能受到幾個基因的作用，新近認為“一個順反子一個mRNA一條多肽鏈”的假說所代替更合情理。應該指出的是酶的合成與停止并不永遠與gene的突變發(fā)生有聯(lián)系的，由于存在有控制基因的作用，必須考慮到酶的合成與停止還要受gene的調(diào)控系統(tǒng)的作用。,廣義遺傳工程包括:生化工程、蛋白質(zhì)工程、細胞工程、染色體工程、細胞器工程、基因工程及酶工程等。,狹義遺傳工程是指:基因工程(重組DNA技術)。,一、基因工程概述:,2-3基因工程,.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設方式按照預先設計的藍圖借助于實驗室技術將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去使后者定向獲得新遺傳性狀的一門技術。基因工程是采用分子生物學、核酸生物化學以及微生物遺傳學的現(xiàn)代方法和手段建立起來的綜合技術。基因工程技術的建立，使所有實驗生物學領域產(chǎn)生巨大的變革。,2.發(fā)展：1971年，Smith等人從細菌中分離出的一種限制性酶，酶切病毒DNA分子，標志著DNA重組時代的開始。1972年，Berg等用限制性酶分別酶切猿猴病毒和l噬菌體DNA，將兩種DNA分子用連接酶連接起來得到新的DNA分子。1973年，Cohen等進一步將酶切后的DNA分子與質(zhì)粒DNA連接起來，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.cloi細胞中。,1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準，用基因工程在細菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。1996年，克隆羊誕生。,1996年全世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積為170萬公頃，1997年為1100萬公頃，1998年為2780萬公頃，1999年達到3990萬公頃，2000年達到4420萬公頃，2001年達到5260萬公頃，2002年達到5000萬公頃。,2001年種植面積已超過100萬公頃的作物有：大豆（3330萬hm2，占全世界轉(zhuǎn)基因作物的63%，均為抗除草劑大豆）、玉米（980萬hm2，占19%）、棉花（680萬hm2，占13%）、油菜（270萬hm2，5%）；其它還有水稻、小麥、花生、向日葵、亞麻、甘藍、馬鈴薯等，番茄、煙草、南瓜和木瓜等50多種轉(zhuǎn)基因作物已實現(xiàn)商品化。主要分布在美國（3570萬hm2）、阿根廷（1180萬hm2）、加拿大（320萬hm2）和中國（150萬hm2）等國。,2001年全世界轉(zhuǎn)基因作物占相應種植總面積的百分率,2001年我國的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木已達22種，其中轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、馬鈴薯、煙草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麥等進行了田間試驗，轉(zhuǎn)基因棉花已經(jīng)大規(guī)模商品化生產(chǎn)。,3內(nèi)容：從細胞和組織中分離DNA；限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；將酶切DNA分子與載體DNA連接構(gòu)建能在宿主細胞內(nèi)自我復制的重組DNA分子；把重組DNA分子引入宿主受體細胞復制；重組DNA隨宿主細胞的分裂而分配到子細胞建立無性繁殖系(Clone)或發(fā)育成個體；從細胞群體中選出所需要的無性繁殖系并使外源基因在受體細胞中正常表達，翻譯成蛋白質(zhì)等基因產(chǎn)物、回收；或篩選出獲得定向的性狀變異的個體。,4.基因工程的操作過程基因工程技術包括三個基本要素：載體、工具酶和表達系統(tǒng)（原核或真核宿主細胞），其技術路線大致包括以下幾個操作程序：準備材料。包括載體和工具酶的準備以及目的基因的分離和制備；構(gòu)建重組DNA分子。把目的基因與載體結(jié)合成重組DNA分子，即進行基因的體外重構(gòu)；外源DNA導入受體細胞。把含外源DNA片段的重組DNA分子引入宿主受體細胞，建立分子無性繁殖系；篩選重組DNA分子、鑒定目的基因表達。從細胞群體中選出所需要的無性繁殖系，并使外源基因在受體細胞中正確表達。,(一)準備材料1.工具酶工具酶指在重組DNA技術中用于切割、連接、修飾DNA或RNA的一系列酶。它們是基因工程中的基本工具，其中最重要的是限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，其它常用工具酶包括DNA多聚酶、反轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶H、堿性磷酸酶等。下面扼要介紹限制性核酸內(nèi)切酶。DNA是巨大分子，進行DNA操作時，必須加以切割，這就需要限制性核酸內(nèi)切酶把DNA鏈在特定部位切斷。1970年開始分離得到的限制性核酸內(nèi)切酶，是開拓基因操作新領域的關鍵。限制性核酸內(nèi)切酶能識別DNA的特定堿基序列，并把DNA鏈在特定位點切斷。,限制性內(nèi)切酶的類別：第類酶:每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性,酶切位點不定。如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300000)，作用時需ATP、Mg+等輔助因子。第類酶:能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。如EcoRI(大腸桿菌)、Hind(嗜血桿菌)，分子量較小(約20000-100000)，作用時需Mg2+存在。,2.載體載體（vector）是指能將目的基因的DNA片段帶入宿主細胞并能進行擴增的一類DNA分子。可作為DNA載體的有質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。作為運載工具，載體必須具備以下條件：在宿主細胞中能自我復制，并能穩(wěn)定地保存；有多種限制性內(nèi)切酶的切點，每種酶的切點最好只有一個，且酶切后并不損壞其復制能力及選擇標志基因（genemarker）的能力，并能嵌入外源DNA片段；能較自由地進入受體細胞，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化；具有可作為重組DNA分子選擇的遺傳標志。,目前作為轉(zhuǎn)入原核細胞宿主的載體主要有兩大類：-噬菌體和細菌質(zhì)粒。而作為轉(zhuǎn)入真核細胞宿主的載體，在動物方面主要有類人猿病毒SV40（SimianVirus40），在植物方面主要有農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒。,質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子?，F(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。,（二）目的基因的分離：工具酶和載體備好了，下一步就是要獲取目的基因。目的基因（target）是指準備導入受體細胞內(nèi)的、以研究或應用為目的所需要的外源基因。獲得目的基因是進行DNA重組最重要的一步，也是十分困難的一步。,獲得目的基因的方法很多，（1）可采用從生物基因組群體中分離目的基因。一般用限制性核酸內(nèi)切酶把一個基因組DNA分成很多片段。原核生物基因組較小，基因容易定位，用限制性內(nèi)切酶將基因組切成若干段后，直接用帶有標記的核酸探針，從中選出目的基因。對于基因組較大的真核生物，則可先制作基因文庫，然后釣取所需要的帶有目的基因的DNA片段而獲得目的基因。,（2）人工合成目的基因DNA片段。人工合成目的基因DNA片段有化學合成法和酶促合成法兩條途徑。一般是采用DNA合成儀來合成長度不是很大的DNA片段。（3）PCR技術合成DNA。聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種簡單的酶促反應，它以DNA變性、復制的某些特性為原理設計的。通過PCR技術獲取所需要的特異DNA片段在實際應用用得非常多，但是前提條件是必須對目的基因有一定的了解，需要設計引物?，F(xiàn)代分子生物學發(fā)展到今天，人類基因組全序列已經(jīng)測出，并且越來越多的模式生物的基因組全序列正在被測出，PCR法已經(jīng)成為分離目的基因的主要手段。,（三）構(gòu)建重組DNA分子外源基因（DNA片段）很難直接透過受體細胞的細胞膜進入受體細胞，即使進入，也會受到細胞內(nèi)限制性酶的作用而分解。要將外源DNA片段導入受體細胞，選擇適當?shù)妮d體是關鍵步驟之一。含有目的基因的DNA片段和載體DNA的連接技術即DNA重組技術，其核心步驟是DNA片段之間的體外連接，其本質(zhì)是涉及限制酶、連接酶等工具酶的酶促反應過程。重組DNA即將載體DNA與引入的DNA連接，把目的基因連接到載體上去。根據(jù)DNA末端性質(zhì)不同，形成重組體DNA分子的方法也有所不同。,1.黏性末端的連接。用同一種限制性內(nèi)切酶或者用能夠產(chǎn)生相同黏性末端的兩種限制性內(nèi)切酶分別消化外源DNA分子和載體，所形成的DNA末端彼此互補，用DNA連接酶共價連接起來，形成重組體DNA分子。2.平齊末端的連接。可先生成黏性末端，在帶平頭末端的DNA片段的3-末端加上多聚核苷酸的尾巴，在載體上加上互補的尾巴，然后用DNA連接酶連接。,(四)重組體的轉(zhuǎn)化(五)克隆子的鑒定(六)目的基因的表達,二、基因工程的應用：目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系列重大突破?；蚬こ碳夹g已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學、法學等領域，為人類創(chuàng)造了巨大的財富。,具有生長激素的轉(zhuǎn)基因鼠,轉(zhuǎn)基因的方法和技術：,基因工程工業(yè)：最早應用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法是在細菌中表達人的胰島素(1982)。胰島素是一種控制糖代謝的蛋白質(zhì)激素。不能產(chǎn)生胰島素的患者會有糖尿病，患者必須每天注射胰島素?，F(xiàn)已在細菌中生產(chǎn)10多種醫(yī)藥產(chǎn)品，如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝類工程疫苗等。,有些真核細胞的蛋白質(zhì)需要糖基化等修飾加工以后才具有活性，而細菌細胞缺少真核細胞的這些修飾系統(tǒng)真核生物細胞更適合于表達真核生物蛋白質(zhì)基因。目前，酵母菌、植物懸浮細胞、植株和動物培養(yǎng)細胞成功地均應用于表達外源蛋白。,基因工程應用大腸桿菌生產(chǎn)人類生長激素,植物基因工程：植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達的過程。許多植物基因已經(jīng)被分離、克隆。植物基因轉(zhuǎn)化技術也得到不斷發(fā)展和完善。應用最多的為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法。,抗蟲稻,對照,根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術：根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉(zhuǎn)化是應用得最早而廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法（雙子葉植物、單子葉植物）。過程：將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌細胞將重組農(nóng)桿菌去感染植物細胞使質(zhì)粒的部分DNA包括目的基因，整合到植物染色體，實現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。利用從抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因