siRNA 沉默人類血紅素敏感基因1 對(duì)膀胱癌T24 細(xì)胞的影響.doc

siRNA沉默人類血紅素敏感基因1對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的影響湯磊1李瑞曉于垂恭袁建林武國軍#湯磊：第四軍醫(yī)大學(xué)，西京醫(yī)院泌尿外科，碩士研究生，710032，email：李瑞曉：第四軍醫(yī)大學(xué)，西京醫(yī)院泌尿外科，碩士研究生，710032于垂恭：第四軍醫(yī)大學(xué)，西京醫(yī)院泌尿外科，博士研究生，710032袁建林：第四軍醫(yī)大學(xué)，西京醫(yī)院泌尿外科，醫(yī)學(xué)博士，科室主任，博士生導(dǎo)師，710032武國軍：第四軍醫(yī)大學(xué)，西京醫(yī)院泌尿外科，醫(yī)學(xué)博士，科室副主任，碩士生導(dǎo)師，710032email：siRNA沉默人類血紅素敏感基因1對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的影響湯磊1李瑞曉于垂恭袁建林武國軍#1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，710032()#第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科，710032（）摘要目的觀察人類血紅素敏感基因1（HRG-1）基因在膀胱正常組織和膀胱腫瘤組織中的表達(dá)情況，通過RNA干擾技術(shù)抑制HRG-1在膀胱癌T24細(xì)胞表達(dá)水平，觀察生長(zhǎng)增殖的變化。方法應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)85例膀胱腫瘤（膀胱乳頭狀瘤25，低級(jí)別膀胱癌30，高級(jí)別膀胱癌30）和20例膀胱正常組織石蠟標(biāo)本中HRG-1表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)臨床病理分析。設(shè)計(jì)針對(duì)HRG-1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞，應(yīng)用免疫印跡法和RT-PCR分析HRG-1siRNA的表達(dá)，MTT和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)增殖凋亡的變化。結(jié)果正常膀胱組織和膀胱癌組織中HRG-1表達(dá)有顯著性差異(P0.05)；HRG-1的陽性表達(dá)與膀胱腫瘤病例分級(jí)、臨床分期之間有顯著性差異(P0.05)；轉(zhuǎn)染siRNA后，HRG-1表達(dá)水平下降，MTT和FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖曲線受到抑制，HRG-1-siRNA組與空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組比較，細(xì)胞凋亡比例增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論HRG-1基因可能參與了膀胱癌的發(fā)病，siRNA-HRG-1處理T24細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖受到抑制，同時(shí)凋亡比例增加。關(guān)鍵詞：膀胱腫瘤，人類血紅素敏感基因，RNA干擾基因，細(xì)胞凋亡siRNAInterferenceofHRG-1onbladdercancerT24invitroTANGLei*，LIRui-xiaoYUChui-gong,YUANJian-lin,WUGuo-jun，eta1*DepartmentofUrology，XijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，ChinaCorrespondingauthor：WuGuo-jun(email:)AbstractObjectiveToobservetheHRG-1geneexpressionincarcinomaofurinarybladderandnormalurinarybladdertissues，andtoinvestigatetheeffectofHRG-1-siRNAontheproliferationandapoptosisofhumanbladdercancercellline.MethodsImmunohistochemistywasusedtodetecttheexpressionofHRG-1in85casesofbladdercarcinomaand20normalbladdertissues,andThesiRNAofHRG-1wasdesigned,synthesizedandtransfectedintobladdercancercelllineT24.ResultsTheHRG-1geneexpressionhadsignificantdifferencesbetweenbladdercarcinomaandnormalbladdertissues(p0.05)；HRG-1genepositiveexpressionhadmarkeddifferencesbetweenthepathologicalgradesandclinicalstagesofbladdercarcinoma(p0.05).AftertreatedwithsiRNA,theexpressionlevelofHRG-1proteinandHRG-1mRNAinT24cellsdecreasedobviously(p0.05).TheapoptosisrateofT24cellstransfectedwithHRG-1-siRNAwassignificantlydifferentfromControl-siRNAgroupandblankgroup(p80%為+。選取具有代表性視野采集圖片。1.4細(xì)胞培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞株T24、5637、BIU-87及人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1均購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。膀胱癌細(xì)胞株T24、5637、BIU-87及人膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-11常規(guī)復(fù)蘇后，在10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：在5%二氧化碳濃度、飽和濕度及37下進(jìn)行。1.5蛋白印跡檢測(cè)(Western-blot)蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。按BCA法進(jìn)行總蛋白定量，取5ug蛋白質(zhì)總量樣品進(jìn)行120g/L的SDS-PAGE凝膠電泳后將凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜(NC)膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜的效果，標(biāo)記Marker的位置。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，鼠抗人HRG-1單克隆一抗、鼠抗人GAPDH多克隆一抗室溫孵育1h，4過夜，選用熒光素標(biāo)記的兔抗鼠二抗，室溫孵育1h，然后使用計(jì)算機(jī)-熒光掃描儀系統(tǒng)對(duì)膜進(jìn)行掃描，保存結(jié)果留待分析。1.6siRNA分析T24細(xì)胞常規(guī)接種于6孔板，用不含雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿60-80%后，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)轉(zhuǎn)染siRNA于T24細(xì)胞。siRNA-HRG-1（NM-017842），HRG-1-siRNA序列為：5-GUGGUCUCCCAGGAAGCUGUdTdT-3,5-ACAGCUUCCUGGGAGACCACdTdT-3，Control-siRNA序列為：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3,反義鏈為5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3。操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作。37孵育6h后，跟換培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育。通過RCR和western檢測(cè)HRG-1基因沉默水平。1.7反轉(zhuǎn)錄PCR分析胰酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每1107細(xì)胞加1mlTrizol裂解液(TaKaRa公司)，其余步驟嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書操作，提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，引物合成與北京奧科公司合作完成，HRG-1引物序列為：5-ATGCCCACCGCTACCGGGCT-3。5-CTACACCTTGACCTCTTGAC-3，理論擴(kuò)增長(zhǎng)度360bp，GAPDH引物序列為：5-AGGTCCACCACTGACACGTT-3，5-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3。反應(yīng)條件如下：HRG-1循環(huán)參數(shù)為95變性5min，9530S、5930S、7230S(35個(gè)循環(huán))，727min；GADPH循環(huán)參數(shù)為95變性5min，9530S，5730S，7230s(30個(gè)循環(huán)),727min。各取30ulPCR反應(yīng)液在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠(EB)染色后照相。KodakDigitalScienceID軟件系統(tǒng)掃描。1.8增殖凋亡檢測(cè)MTT:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，包括siRNA處理的T24細(xì)胞（轉(zhuǎn)染24h后），以1104/ml接種于96孔板中，每孔加入200ul，每板接種6個(gè)復(fù)孔，1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。12h后選擇一塊，每孔加入20ul（5mg/ml）MTT試劑。37C孵育4h，棄上清，每孔加入150ulDMSO，震蕩10min，490nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值，取平均值；以后每隔12h，取出一塊板，重復(fù)上述操作。FCM:將T24細(xì)胞以5105接種于6孔板中，siRNA處理24,48h后，收獲細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，無水乙醇固定，并設(shè)空白對(duì)照。然后用350ul結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每組處理細(xì)胞分別加入10ul碘化丙錠(PI)和凋亡檢測(cè)試劑5ulAnnexinV-FITC(Bipec公司)，4下避光染色15min，上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞周期凋亡分析采用美國BectonDiekinson公司的CellQuitPlot分析軟件分析細(xì)胞增殖和凋亡的變化。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS170統(tǒng)計(jì)軟件分析，采用了卡方檢驗(yàn)、單因素方差分析及多樣本兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),以p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1HRG-1基因在膀胱腫瘤組織和正常膀胱組織中的表達(dá)HRG-1的陽性反應(yīng)物質(zhì)主要在胞漿內(nèi)。HRG-1在膀胱正常組織中的陽性表達(dá)率為25(5/20)，而在膀胱腫瘤組織中的陽性表達(dá)率為71.8(61/85)，兩組表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=15.166，P0.001)，可認(rèn)為HRG-1在膀胱腫瘤組織中陽性表達(dá)率高于膀胱正常組織(表1，圖1)。HRG-1的表達(dá)水平與性別、年齡無相關(guān)性，與臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)（r=0.38，p0.01），也就是說，HRG-1的陽性表達(dá)強(qiáng)度隨著腫瘤惡性程度的增高而加強(qiáng)（表2）。2.2HRG-1在不同膀胱癌細(xì)胞株的表達(dá)水平Western-blot結(jié)果顯示：在蛋白的表達(dá)水平上，4種不同細(xì)胞株HRG-1都有表達(dá)，且3個(gè)膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)均高于人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-11，3個(gè)膀胱癌細(xì)胞株中，以T24的HRG-1表達(dá)水平最高，而5637、BIU-87的表達(dá)水平相當(dāng)且低于T24(圖2)。2.3siRNA處理T24細(xì)胞株后，HRG-1基因表達(dá)水平檢測(cè)測(cè)得最佳感染濃度和最佳感染時(shí)間為40nm，48h。HRG-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平通過RT-PCR和western來檢測(cè)。與空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組相比，HRG-1的表達(dá)水平通過siRNA處理后，表達(dá)下降。HRG-1-siRNA轉(zhuǎn)染組與空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組T24細(xì)胞相比較，T24細(xì)胞中HRG-1蛋白水平和mRNA明顯下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(圖3)。2.4siRNA處理T24細(xì)胞株后，對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響T24細(xì)胞株轉(zhuǎn)染24h后，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：siRNA處理T24細(xì)胞后，HRG-1-siRNA較其空載體組和空白組的細(xì)胞增殖受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）（圖4）。FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染24h后，HRG-1-siRNA凋亡率為(12.872.04)%，對(duì)照組為(3.371.07)%，空白組為(3.340.88)%；48h后，HRG-1-siRNA凋亡率為(14.732.16)%，對(duì)照組為(3.670.94)%，空白組為(3.721.13)%。感染組細(xì)胞凋亡較對(duì)照組和空白組凋亡比例明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）,表明HRG-1-siRNA可促使T24細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖5)。3討論膀胱癌是我國泌尿系腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，是繼前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌之后，為男性高發(fā)惡性腫瘤第四位。在女性惡性腫瘤亦排在十位之后4。肉眼血尿是膀胱癌最常見的臨床癥狀，尤其是出現(xiàn)間斷性全程無痛血尿時(shí)應(yīng)考慮到膀胱癌的可能。2001年Elbashir等首次把特異性的siRNA轉(zhuǎn)入人癌細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靶向蛋白的表達(dá)量比轉(zhuǎn)染下降了90%5。近年來，siRNA的研究受到廣泛的關(guān)注。HRG-1是人類溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC家族的一個(gè)新成員，以前一直作為假定蛋白存在，其功能和作用還一直不為人們所知，直到2008年，Rajagopal6等利用秀麗隱桿線蟲和相關(guān)寄生蟲具有天然的血紅素營(yíng)養(yǎng)缺陷性，敲除斑馬魚HRG-1基因，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)了腦積水等情況，而且，重度紅細(xì)胞生成表型缺陷可被HRG-1蛋白修復(fù)，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)HRG-1所表達(dá)的蛋白是蠕蟲及脊椎動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)血紅素的穩(wěn)態(tài)和正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的。因此將其正式命名為HRG-1（heme-responsivegene1）。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HRG-1基因在膀胱癌中發(fā)揮著重要的作用。免疫組化發(fā)現(xiàn)HRG-1的陽性表達(dá)率在膀胱腫瘤組織中明顯低于正常膀胱組織，表達(dá)水平與年齡性別無相關(guān)性，與腫瘤病理分期呈負(fù)相關(guān)。Western-blot檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)3種膀胱癌細(xì)胞株(T24、5637和BIU-87)的HRG-1表達(dá)水平均高于人膀胱上皮細(xì)胞(SV-HUC-11)，T24的表達(dá)量為最高，我們利用siRNA干涉技術(shù)處理T24細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)HRG-1基因的瞬時(shí)低表達(dá)，通過MTT和FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HRG-1-siRNA可以抑制T24細(xì)胞的增殖，凋亡比例增加。這表明下調(diào)HRG-1的表達(dá)水平，可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，凋亡比例增加。通過HRG-1基因的相關(guān)研究的報(bào)道，我們猜測(cè)，HRG-1基因作為血紅素敏感性基因，它可能是通過細(xì)胞的分化、呼吸、代謝等生物學(xué)進(jìn)程來調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展影響血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)影響到血紅素對(duì)細(xì)胞的分化作用7-10；其次，HRG-1作為一種跨膜蛋白，可能影響著細(xì)胞的攜氧能力，從而影響著血管的形成，這也可能是它在癌組織中高表達(dá)的原因之一，這也為膀胱癌的診斷和治療提供了一定的可能性。1A.KarimKader.BladderCancer.TheScientificWorldJOURNALJ.(2011)11,256525662WangYong,ShaoChen,ShiChanghong,ZhangLei,QinWeijun,LiFan.ChangeofthecellcyclerelatedafterflutiamidetreatmentinprostatecancercellsanditsmolecularmechanismJ.AsianJofAndrol,2005,7(4):375-3803SHAOC，WANGY，YUEHH，eta1Biphasiceffectofandrogensonprostatecancercellsanditscorrelationwithandrogenreceptorcoactivatordopadecarb0xylaseJJAndrol，2007，28(6)：8048124JemalA,SiegelR,WardE,etal.Cancerstatistics2008J