3種經(jīng)典工藝生產(chǎn)的金銀花提取物中糖類成分含量比較.doc

3種經(jīng)典工藝生產(chǎn)的金銀花提取物中糖類成分含量比較作者：陳有根張蓉鄔國(guó)慶王志斌【摘要】：目的比較3種經(jīng)典工藝生產(chǎn)的金銀花提取物中果糖、葡萄糖、蔗糖和總糖的含量差異,為指導(dǎo)含金銀花中成藥的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法用經(jīng)典的水-醇法、石-硫法和改良石-硫法生產(chǎn)金銀花提取物樣品,用高效液相-梯度洗脫法測(cè)定3種提取物樣品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,用分光光度法測(cè)定3種提取物樣品中總糖含量。結(jié)果3種提取物中果糖含量分別為5.44%、3.47%、4.74%,葡萄糖含量分別為4.35%、2.73%、4.21%,蔗糖含量分別為17.41%、8.47%、14.47%,總糖含量分別為50.63%、41.12%、35.90%。結(jié)論測(cè)定了金銀花提取物中除綠原酸類以外的36%51%總成分含量,并揭示了其中19%27%的化學(xué)成分組成為果糖、葡萄糖、蔗糖。【關(guān)鍵詞】金銀花提取物果糖葡萄糖蔗糖Abstract：ObjectiveTodeterminethecontentsoffructose,glucose,sucroseandtotalsaccharideinhoneysuckleextractswhichwereproducedbythreeclassicalmethods,toprovidescientificdataforproducingandcontrollingofthosepatentmedicinescontaininghoneysuckleextract.MethodsThreeclassicalextractmethodswereusedforproducinghoneysuckleextracts.HPLC-ELSDmethodwasusedfordeterminingthecontentsoffructose,glucose,sucrose,andaspectrophotometricdeterminationmethodwasusedfordeterminingthecontentsoftotalsaccharide.ResultsThecontentsoffructoseinthreehoneysuckleextractswere5.44%,3.47%,4.74%,glucosewere4.35%,2.73%,4.21%,glucosewere17.41%,8.47%,14.47%,andtotalsaccharidewere50.63%,41.12%,35.90%,respectively.ConclusionAbout36%51%oftotalcomponentsofhoneysuckleextractsweredeterminedexceptchlorogenicacids,and19%27%ofcomponentsintheextractswerefructose,glucose,sucrose.Keywords：honeysuckleextract；fructose；glucose；sucroses金銀花為常用中藥,來(lái)源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾,具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功能。金銀花提取物是生產(chǎn)多種中成藥制劑的中間原料。中華人民共和國(guó)藥典和衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中收載的金銀花提取物的生產(chǎn)工藝有3種,即：水-醇法1、石-硫法2和改良石-硫法3,它們均屬于有法定標(biāo)準(zhǔn)的工藝方法。用這3種工藝生產(chǎn)的提取物分別作為雙黃連、茵梔黃和銀黃注射液的中間原料。這3種注射劑在臨床都有十余年的使用歷史,其療效得到眾多臨床醫(yī)生和患者的肯定。關(guān)于金銀花提取物的質(zhì)量控制報(bào)道較多,多數(shù)以綠原酸含量作為控制指標(biāo),未見(jiàn)用糖類成分作為指標(biāo)對(duì)金銀花提取物進(jìn)行質(zhì)量控制研究的報(bào)道。本試驗(yàn)采用RP-HPLC-ELSD法測(cè)定了3種經(jīng)典工藝生產(chǎn)的金銀花提取物中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,本研究可為含金銀花中藥注射劑的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供具有實(shí)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1儀器與試藥Agilent-1100高效液相色譜儀,四元泵,自動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱,AlltechELSD2000ES檢測(cè)器,AgilentA10.02工作站。島津UV-2450PC型可見(jiàn)-紫外分光光度儀。果糖、葡萄糖和蔗糖對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)；金銀花藥材(采自山東省平邑縣白彥鎮(zhèn))。乙腈為色譜純,水為去離子水,其它試劑均為分析純,苯酚重蒸后用水配成5%的溶液。2方法與結(jié)果2.1果糖、葡萄糖和蔗糖的含量測(cè)定2.1.1色譜條件色譜柱：Inertsil-NH2(4.6mm250mm,5m)；流動(dòng)相：乙腈-水(7822)；流速：1mL/min；柱溫：30；ELSD檢測(cè)器氮?dú)饬魉?.2L/min,漂移管溫度85。2.1.2供試品溶液的制備取金銀花提取物A、B、C細(xì)粉300mg(3種提取物樣品的制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)4),精密稱定,分別置50mL量瓶中,加70%乙醇至刻度,超聲(600W)處理10min,0.45m微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,備用。2.1.3線性關(guān)系考察分別精密稱取果糖、葡萄糖和蔗糖適量,加70%乙醇制成每1mL含果糖1.484mg、葡萄糖1.456mg和蔗糖2.648mg的混合對(duì)照品溶液。精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,置10mL量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻,制成系列混合對(duì)照品溶液。按上述色譜條件分別進(jìn)樣10L,以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)(lnm)為橫坐標(biāo),峰面積的自然對(duì)數(shù)(lnA)為縱坐標(biāo),計(jì)算,得果糖的回歸方程為：lnA1.3086lnm7.9464,r0.9996,線性范圍為0.7287.280g；葡萄糖的回歸方程為：lnA1.2771lnm7.9793,r0.9996,線性范圍為0.7427.420g；蔗糖的回歸方程為：lnA1.2577lnm7.9826,r0.9999,線性范圍為1.32413.420g。2.1.4系統(tǒng)適應(yīng)性在上述色譜條件下測(cè)定,結(jié)果表明,理論塔板數(shù)以果糖峰計(jì)算為12745,以葡萄糖峰計(jì)算為5578,以蔗糖峰計(jì)算為13425(見(jiàn)圖1)。2.1.5精密度試驗(yàn)取果糖、葡萄糖和蔗糖質(zhì)量濃度分別為0.2968、0.2912和0.7944mg/mL的混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,每次10L,以果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面積計(jì)算進(jìn)樣精密度,RSD分別為1.62%、1.59%和1.50%。2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)取提取物C,按供試品溶液制備方法制備5份供試液,依法測(cè)定,計(jì)算,得果糖平均含量為4.74%(RSD1.43%),葡萄糖平均含量為4.21%(RSD1.52%),蔗糖平均含量為14.47%(RSD1.49%)。2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液,每隔2h進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果5次測(cè)定的果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面積基本不變,RSD分別為1.03%、1.12%、1.46%,表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.8加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定含量的提取物C細(xì)粉150mg,5份,精密稱定,分別置50mL量瓶中,精密加入果糖、葡萄糖和蔗糖質(zhì)量濃度分別為0.2968、0.2912和0.7944mg/mL的混合對(duì)照品溶液25mL,再加70%乙醇至刻度,超聲(600W)處理10min,0.45m微孔濾膜濾過(guò),依法測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表1表3。表1果糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(略)表2葡萄糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(略)表3蔗糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(略)2.1.9樣品測(cè)定取上述3種金銀花提取物,按“2.1.2”項(xiàng)下操作制備供試品溶液,各3份,按上述色譜條件測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖的含量,結(jié)果見(jiàn)表4。表4樣品含量測(cè)定結(jié)果(略)2.2總糖含量測(cè)定2.2.1供試品溶液的制備取金銀花提取物細(xì)粉100mg,精密稱定,置50mL量瓶中,加水至刻度,超聲處理10min,取出,冷卻至室溫,精密吸取1mL,置25mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得。2.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取顯色后的對(duì)照品和供試品溶液,在400700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果表明,對(duì)照品溶液和供試品僅在490nm處有1個(gè)吸收峰,因此,選擇490nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。2.2.3線性關(guān)系考察精密稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品,加水使溶解制成每1mL含無(wú)水葡萄糖0.0446mg的對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10mL,置10mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,制得系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取系列對(duì)照品溶液2mL于具塞試管中,加5%苯酚試液1.0mL,混勻,迅速加5.0mL濃硫酸,密塞,搖勻,置沸水浴加熱15min,取出,迅速置冰水中冷卻,以5%的苯酚-硫酸溶液為空白,于490nm處測(cè)定吸收值。以對(duì)照品濃度(C)為橫坐標(biāo),吸收度(A)為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程為：A14.589C0.1311,r0.9992(n3)。結(jié)果表明,葡萄糖在8.9244.60g/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。2.2.4精密度試驗(yàn)取金銀花提取物C細(xì)粉100mg,精密稱定,置50mL量瓶中,加水至刻度,超聲處理10min,取出,冷卻至室溫,精密吸取1mL,置25mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,精密吸取2mL,5份,依法顯色,測(cè)定吸收值,結(jié)果RSD0.27%。2.2.5重復(fù)性試驗(yàn)取金銀花提取物C細(xì)粉100mg,5份,精密稱定,分別置50mL量瓶中,依法處理,顯色,測(cè)定吸收值,計(jì)算,得總糖平均含量為35.90%(RSD1.32%)。2.2.6顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液,測(cè)定時(shí)間-吸收值曲線,結(jié)果在30min內(nèi)吸收值基本不變,表明供試品溶液顯色后在30min內(nèi)穩(wěn)定。2.2.7加樣回收率試驗(yàn)取金銀花提取物C細(xì)粉50mg,5份,精密稱定,分別置50mL量瓶中,分別精密加入無(wú)水葡萄糖對(duì)照品30mg,加水至刻度,依法處理,顯色,測(cè)定吸收值,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表5。表5總糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(略)2.2.8樣品測(cè)定分別取金銀花提取物細(xì)粉100mg,精密稱定,置50mL量瓶中,依法處理,顯色,測(cè)定吸收值,計(jì)算含量,結(jié)果見(jiàn)表6。表6總糖樣品含量測(cè)定結(jié)果(略)3討論雙黃連、茵梔黃和銀黃注射液是目前國(guó)內(nèi)使用最廣的3種含金銀花的中藥注射劑,在臨床都有十余年的使用歷史,以其療效好、起效快、給藥方便而得到眾多臨床醫(yī)生和患者的肯定。然而,近年來(lái)頻頻發(fā)生的危及患者生命安全的中藥注射劑不良反應(yīng)(其中含金銀花的中藥注射劑尤其突出),又使人們對(duì)中藥注射劑的認(rèn)識(shí)蒙上了一層面紗。因此,中藥注射劑中功效成分以外的化學(xué)組分也成了此類制劑質(zhì)量控制的關(guān)注焦點(diǎn)。我們?cè)?jīng)報(bào)道了上述3種金銀花提取物樣品中的綠原酸、3,5-二咖啡?；鼘幩岷涂偩G原酸的含量4,本實(shí)驗(yàn)分別用HPLC方法測(cè)定了這3種提取物中除綠原酸類成分外18%27%的化學(xué)組分,用分光光度法測(cè)定了其中除總綠原酸以外36%51%的總成分含量,使我們對(duì)含金銀花的中藥注射劑的組分有了更明確的了解。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為指導(dǎo)含金銀花中藥注射劑的生產(chǎn)以及質(zhì)量控制提供具有實(shí)用價(jià)值的研究方法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),