石蠟切片技術.ppt

第二章 石蠟切片技術,一、顯微切片技術產(chǎn)生的原因,光學顯微鏡發(fā)展到一定程度之后，渴望知道細胞結構 由于組織太厚，光線很難穿過 壓片可使組織變薄，但引起變形、易位，除核外，看不到其他結構，因此需要切片變薄。 因細胞水多，太軟，無法切片 鑒于上述情況找到一種方法使細胞水被替代，變硬，能直接切片的方法，最廣泛使用的就是石蠟切片技術,二、石蠟切片技術的優(yōu)點,為什么選擇這一技術呢？主要因為它有以下優(yōu)點：便于推廣、經(jīng)濟、適用、簡便。 經(jīng)濟,價格低，可反復使用； 技術難度不大，容易掌握，但要精通也不容易； 設備要求不高 ； 可長期保存； 染色容易，而且都能被染色，形成好的反差和好的選擇性。,三、石蠟切片的主要過程,殺生（取材）固定沖洗脫水保存透明石蠟透入包埋切片復水染色脫水封藏觀察保存 （一）取材、固定、洗滌、脫水 （二）透明、透蠟、包埋 （三）切片、貼片 （四）染色、封藏,（一）取材,殺生（動物） 1.目的：動物必須殺生，然后取出所需組織 2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖，取出所需組織。 3.注意事項： 性別合適 麻醉前動物生活正常，以免影響其代謝活動，進而影響細胞結構 取材部位要準， 速度快,（一）取材,1.目的：得到所需要的組織 2.方法：a.用剪刀剪下組織 b.沖洗動物組織，動物（生理鹽水、糜蛋白酶溶液）植物（緩沖液或水）沖洗干凈，防止失水，避免壓擠損傷，用生理鹽水、糜蛋白酶沖去表面的血、粘液和贓物。 c.切成小塊 3注意事項： 要準 要快 避免損傷（方向，刀要快，不能擠壓） 植物取材：用剪刀剪下材料時一定要植物生活正常，不要因缺水、營養(yǎng)和溫度光照發(fā)生明顯改變，影響細胞結構，同時發(fā)育程度、部位要準。,（二）固定,1.目的： 為了使取樣的細胞在形態(tài)結構和成分方面保持與生活的狀態(tài)一樣，就必須迅速殺死細胞避免失水變形，自溶破壞結構等。 固定液的選擇：快；不溶解；不收縮膨脹；軟硬適中；增加折光度；增加染色能力；長期保存等7項。,2.方法,（1）固定劑的種類：一般采用化學固定 單純固定：只用一種試劑固定： 混合固定：用兩種或兩種以上的試劑混合在一起進行固定如：,單純固定：,福爾馬林formalin:10%的甲醛（37%40%） 醋酸（0.3%5%） 苦味酸（飽和溶液，三硝基苯酚） 鉻酸0.51% 鋨酸12% 升汞（氯化汞飽和水溶液約7%）,混合固定：,用兩種或兩種以上的試劑混合在一起進行固定如： 卡諾氏固定液 酒精：冰醋酸（3：1） 酒精：冰醋酸：氯仿（6：1：3）適用于動植物一般組織細胞。 FAA 福爾馬林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收縮;還可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸發(fā)和材料變硬. 但單細胞及絲狀藻類除外，也不適于細胞學研究,卡諾氏固定液(Carnoys Fluid) 適用于一般植物組織和細胞的固定,常用于根尖,花藥壓片及子房石蠟切片等.有極快的滲透力,根尖材料固定1520min即可,花藥則需1h左右,此液固定最多不超過24h,固定后用95%酒精沖洗至不含冰醋酸為止;如果材料不馬上用,需轉(zhuǎn)入70%酒精中保存.固定液的重要特性是能迅速穿透細胞，將其固定并維持染色體結構的完整性，還要能夠增強染色體的嗜堿性，達到優(yōu)良染色效果。,F.A.A固定液 又稱標準固定液,萬能固定液.適用于一般根,莖,葉,花藥,子房組織切片.在植物形態(tài)解剖研究上應用極廣; FAA固定液的優(yōu)點在于：兼有保存劑作用,冰醋酸既能抵消酒精和甲醛對組織的收縮作用又是細胞核的優(yōu)良固定劑，沉淀核蛋白，且對免疫組化無礙更無掉片之理。FAA固定液具有強大的固定效能，較之單純固定更科學更快更好！ 對染色體的觀察效果較差.,（2）固定方法,靜置固定：將組織塊放入盛有固定液的小的稱量瓶、小燒杯或青霉素瓶中，在室溫或低溫（04）固定一段時間，不斷搖動能增加固定效果，植物和動物經(jīng)常使用這種方法。 灌注固定：常用于動物，將固定液通過已麻醉的動物血管中，讓血液流動，固定所需細胞，該方法有點，固定均勻，不出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，但較繁瑣。,3.固定時應注意的事項,固定條件的選擇：種類、濃度、溫度和時間 固定要快否則會自溶： 組織快，不能太多，否則固定不透：,（三）沖洗,1.沖洗的目的 除去固定劑，主要是防止固定的毒害作用，固定時間太長，組織收縮變脆。,2.沖洗的方法, 沖洗液隨固定液而定，沖洗的選擇：不形變提取，不反應，有效除去固定液。 固定液為水溶液時，以水或低濃度的酒精沖洗； 固定液是酒精多以不同濃度的酒精沖洗，以酒精沖洗，濃度要低于固定液的酒精濃度。材料與酒精的比例一般為1：10（加入的體積） （70%乙醇換洗3次，每次2060min ）,（2）沖洗方法,靜置沖洗：加入沖洗液，靜置一段時間，倒出該液，加入新的沖洗液，反復幾次（56次），每次30分鐘左右，振蕩有好處。（時間開始一次為2030分鐘，以后幾次可延長12h，）具體時間與材料性質(zhì)、大小和溫度有關。 流水沖洗：將小瓶用紗布蒙住，放入盆中，流水沖洗，效果較靜置沖洗為好，時間為1224h，但流水不能太大太急，也不能太長，太長使組織變軟腫脹，沖洗時間有時長達24h左右，如木本植物的木質(zhì)部。,3.注意事項,(1) 沖洗徹底否則收縮、變硬、抽取 (2)不能時間太長太急變軟，腫脹（吸水） (3) 搖動有利于沖洗干凈加快分子運動,（四）脫水,1. 目的： 因石蠟與水不混合，在用石蠟透入前必須將細胞中的水徹底脫掉，否則石蠟進不去材料，無法讓細胞變硬，無法進行切片。,2.方法,脫水劑的選擇 原則：凡與水和石蠟親和性好的且不使細胞劇烈收縮膨脹，不能大量抽提細胞成分均可作為脫水劑。常用的是乙醇和丙酮，使用乙醇最多，此外還有叔丁醇、正丁醇等。 脫水的一般過程：多采用靜止脫水15%35%50%70%83%95%100%（23次），丙酮較酒精快，濃度相應低一些。起始濃度的選擇主要根據(jù)材料的性質(zhì)而定，動物和幼嫩植物一半從15%或35%開始；老的或木質(zhì)成分多從15%或70%開始。如木本植物的莖。 脫水時間：每次脫水時間也是根據(jù)細胞的老嫩即含水量和組織塊大小及溫度而定，原則是嫩短老長，嫩的15-30m，老的30m-4h，還可長達8-12h，如洋蔥一般為1h 脫水的溫度：室溫和0-4C兩種，前者時間短，后者緩慢一些。,3.注意事項：,脫水一定要脫干凈，徹底，否則石蠟很難進入而導致不能切片。 脫水時間長短要合適，太短脫不干凈，太長低濃度容易細胞變軟，膨脹；太長高濃度則細胞收縮，變脆，提取嚴重，影響切片。 梯度不能太大，負責拉傷，最后100%乙醇脫水要2-3次，以保證脫水完全。 保存，只能在70%酒精中保存（04）若時間不夠可暫時保存在70%酒精中過夜，第二天再繼續(xù)實驗。也可長期保存幾個月，在1：1：1=甘油：蒸餾水：95%酒精中保存最好（低溫）,（五）透明,1.目的： 為了使石蠟更好進入組織，解決乙醇與石蠟親和性較差的問題，并能增加遮光系數(shù)，且與封藏劑很好混合；,2.方法：,（1）透明劑的種類 a.選擇的原則：與乙醇和石蠟均有較好的親和性，又不破壞細胞結構（形態(tài)、結構）不能大量提取細胞成分 b.種類：二甲苯、氯仿、香柏油，苯胺油，其中以二甲苯最好 （2）透明過程 （乙醇：二甲苯）2:11:11:2純（二甲苯）但有時也只用1：1和純的二甲苯即可，時間要長（1h）純的二甲苯要多換幾次保證去乙醇完全。 （3）時間：隨組織塊大而異，也與溫度有關。一般為30m2h，如洋蔥根尖為每次1h （4）溫度：多常溫。,3.注意事項,（1）透明要完全徹底除去乙醇或丙酮 （2）時間過長會使組織變硬變脆，出現(xiàn)收縮，過短，透明不徹底，乙醇除不盡，石蠟進入不好，會出現(xiàn)空洞。 （3）換二甲苯是要快，因二甲苯易揮發(fā)使?jié)舛雀淖?（4）蓋嚴防止水分和空氣（CO2）進入，出現(xiàn)混濁和酸度變化因而受酸影響。,（六）石蠟透入,1.目的： 讓石蠟透入細胞，代替二甲苯支持細胞，增加強度，防止在切片時細胞變形和破碎，便于切片。,2.透蠟,（1）對石蠟的要求 （2）透蠟的過程,（1）對石蠟的要求,熔點已知 質(zhì)量：結構細膩， 光滑均勻 無灰塵和揮發(fā)物；a透明：b無不透明的物；c 無氣泡 種類：石蠟熔點在4260之間，包埋石蠟在5060之間，可分為兩種軟石蠟5256（動物）硬石蠟5458（植物）浸片（4um以下）用5660為好。,石蠟好壞可用以下方法辨別： a.熔入紙盒中無氣泡（揮發(fā)物；） b.無不透明顆粒（灰塵），斷裂處無顆粒（灰塵，切片無細小顆粒（灰塵） C.在30-35放置24小時無氣泡或不透明結晶狀小點。 不好石蠟的利用： 加熱至開始冒煙后移至火焰較小的的燈上，再加熱數(shù)小時，除去揮發(fā)物和水分； 冷卻后雜質(zhì)下沉可除去，所以使用過的石蠟可再重復利用切效果較好。,透蠟的過程,植物：二甲苯:石蠟純石蠟 50ml燒杯2個 1/2二甲苯1/2石蠟石蠟石蠟，根據(jù)組織塊的大小，每步20min60min，溫度62 換蠟的方法：A：移材料： B:倒石蠟 動植物材料在透蠟的過程中前者時間短后者時間長，透蠟時以換蠟不轉(zhuǎn)移材料為好。 動物：從透明劑中取出透明劑石蠟混合液（1520min）純石蠟換一次新鮮石蠟。（透蠟時間為11.5h）洋蔥根尖為1h。,3.注意事項：,（1）透蠟要完全不能殘留二甲苯； （2）溫度恒定，以較低溫度為好，較高溫度提取嚴重，因為二甲苯和石蠟都是脂類物質(zhì)容物； （3）時間合適，較短為好，否則會變硬變脆出現(xiàn)收縮。,（七）包埋,1.目的：以石蠟代替細胞中水分變硬，形成含有材料的石蠟塊，體積增大，便于切片也便于保存； 2.方法： （1）石蠟選擇同包埋，讓透蠟后的組織塊包埋在石蠟中，形成一定的形狀。 （2）準備：折紙盒，準備溫臺（或電熱板）和酒精等及新鮮石蠟，解剖針、標簽和一盆冷水 （3）倒蠟 （4） 冷卻,操作：,紙盒標簽加組織倒石蠟撥正組織塊放入水盆沉底 盆中放滿冷水，點燃溫臺下的酒精燈或（電熱板），放3個解剖針和紙盒在溫臺上. 將標簽放入盒底，文字朝下 將溫箱中取出的石蠟杯，將材料撥入紙盒內(nèi)，再倒入新鮮的石蠟，將材料撥到適當位置。 將紙盒輕輕提取放入盆面，表面凝固后傾斜使冷水進入盒中，立即沉入水中迅速冷卻，30min1h可取出，取出蠟條備用。,3.注意問題：,（1）包埋時石蠟不能過早冷卻（放在溫臺上） （2）冷卻要快 （3）若出現(xiàn)白色、渾濁結晶，可能是由于： a.脫水不干凈； b.組織內(nèi)部或石蠟中混有透明劑； c.組織塊倒入時，周圍蠟已凝固： d.石蠟冷卻太慢； e.石蠟質(zhì)量不好。,（八）切片,1. 目的：將觀察的材料變薄，光線容易穿過； 2方法： （1）固定：取出蠟塊，修整材料長條形，避免損傷。然后將底部粘于金屬和滲蠟木塊上。 （2）修塊：修塊使切片成蠟帶而不彎曲，組織便于鏡檢，組織塊需要修整齊，最好為梯形、長方形、正方形。 組織塊必須上下平行，但左右的蠟、上下的蠟不要太多或太少；正方形或長方形，可各切去一角，以便識別。,切片：,切片機 結構： A：微動裝置（調(diào)節(jié)切片厚薄） B：夾刀部分； C：夾物部分。 兩類： 滑行切片機：劃刀部分是滑動的；夾物部分是固定不變的，但可升降； 旋轉(zhuǎn)式切片機：則是夾物部分上下向前移動，而夾刀部分固定不動，最薄切2um，最厚40um。,切片刀： 雙平面刀（兩面平，兩種機型均可） 平凹刀（一面平，一面內(nèi)凹） 雙凹刀（兩面都凹） 保安刀片 玻璃刀,切片方法 將切片材料的木塊夾在刀夾上，厚度一般612um，連續(xù)轉(zhuǎn)4050次，用毛筆挑起蠟帶，平放在蠟光紙上，靠刀的一面較光滑，應向下。 鏡檢組織細胞是否完整，有無空洞，皺褶，碎裂等。,貼片,將燙板加熱到35度左右； 載玻片涂上蛋白甘油，用手涂抹（蛋清：甘油1：1，加1%的麝香草；滴加蒸餾水數(shù)滴，放上蠟帶切斷，應短于載玻片的1/5或2/5）將載玻片移置燙板上，使片展平； 除去多余水分再放至燙板（35度）23h后即可。,3.切片中經(jīng)常出現(xiàn)的問題及其原因,隔片（太軟，刀太鈍） 刀痕（刀有缺口，石蠟中有硬的顆粒） 脫片（不干凈；粘片劑變質(zhì)；切片光面未向下；切片太小而厚；組織過硬；切片未充分展開；切片貼片面未充分干燥（組織部分呈白色）。 彎曲（不平行） 不成帶（石蠟太少：溫度低） 卷筒（溫度過低，過硬，太鈍） 粘刀：（溫度太高，過軟，太鈍） 縱裂：（缺口；顆粒，太硬） 厚薄不均：夾的太松，刀的傾角太大，太硬）,（九）染色,1. 目的：增大反差，增大選擇性 2. 原理：有兩種學說 物理作用： 化學學說：它認為染色深淺完全取決于化學作用所致如細胞質(zhì)呈堿性，細胞核呈酸性，紅血球呈中性，因而分別被酸、堿和中性染料親和而起反應。 物理學說和化學學說都較片面，不能全面深入解釋許多現(xiàn)象，如孚爾根反應，既有無色品紅與染色質(zhì)之間的化學反應，有選擇性，但長時期浸入水或酒精中也會部分或全部退色（綜合學說）,3.染色劑的種類： 天然：地衣紅（cicein、蘇木精chematoxylin、洋紅carmine（胭脂塵）是從雌性胭脂蟲粉末中提出 人工：苯胺（從苯胺制成的苯胺染料aniline dyes） 堿性：番紅、結晶紫（核）； 酸性：固綠、署紅（質(zhì)）； 中性染色的如賴特（wright）和吉姆薩Giemsa（血球）血液染劑,植物組織切片經(jīng)番紅、固綠雙重染色,1 脫蠟 二甲苯(2)二甲苯(1)，每步510min； 2 復水 1/2乙醇+1/2二甲苯100%乙醇(2) 100%乙醇(1) 85%乙醇 70%乙醇 50%乙醇 30%乙醇蒸餾水,每步2min； 3 初染 植物切片浸入苯胺番紅染液中12h，盡量使紅色浸透，否則容易褪色。（也可在石蠟包埋前用番紅進行整體染色。 4.浸洗 蒸餾水浸