土壤碳氮比對平邑甜茶幼苗生長和碳氮分配的影響.ppt

土壤碳氮比對平邑甜茶幼苗生長和碳氮分配的影響,摘要,為探討土壤碳氮比(C:N)對蘋果(Malus pumila)植株生長和碳氮分配特性的影響, 采用碳氮雙標記示蹤技術, 以二年生平邑甜茶(Malus hupehensis)幼苗為試驗材料, 研究了6個不同土壤C:N處理(T1T6分別為4.70、9.78、14.70、19.96、25.60和28.83)下平邑甜茶的生長狀況和氮素吸收、利用分配以及碳水化合物的運轉特性。結果表明, 隨著土壤C:N的逐漸增大, 平邑甜茶幼苗根系干重逐漸增加, 而株高、莖粗、地上部干重和植株總干重呈先增加后降低的趨勢, 以T4處理最大。土壤C:N顯著影響了平邑甜茶幼苗的15N利用率, 從T1到T4處理, 植株的15N利用率逐漸升高, T4處理(18.46%)是T1處理(10.65%)的1.73倍; 隨著土壤C:N的進一步增加, 植株的15N利用率逐漸降低, T5和T6處理分別比T4處理降低了1.59%和2.58%。土壤C:N較低的T1和T2處理, 平邑甜茶幼苗各器官從肥料中吸收分配到的15N量對該器官全氮量的貢獻率(Ndff)大小順序為根葉莖, 隨著土壤C:N的進一步增大, 葉片的Ndff均為最大, 其次是根, 莖最少。隨著土壤C:N的增大, 葉片15N分配率逐漸升高, 13C分配率逐漸降低; 而根系15N分配率逐漸降低, 13C分配率逐漸升高。綜合考慮植株生長和氮素利用狀況, 本試驗條件下適宜平邑甜茶生長的土壤C:N為2123。,引言,我國是世界蘋果(Malus pumila)第一生產大國,2011年全國蘋果種植面積約199萬hm2、總產量35 106噸, 分別占全世界的1/3和1/4, 果業(yè)逐漸成為蘋果產區(qū)農民增收的重要支柱產業(yè)。由于片面地追求高產, 大量的無機化肥被應用到蘋果生產中, 而肥料的過量施用在提高產量的同時, 也帶來了土壤質量下降、生態(tài)環(huán)境惡化等不良后果。土壤中的有機碳和氮素是地表植被生長的主要營養(yǎng)源, 常被作為土壤質量評價和土地可持續(xù)利用管理的重要參考指標, 也是陸地土壤碳庫和氮庫的重要組成部分, 它們不僅反映土壤肥力水平, 也印證區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)演變規(guī)律, 它們之間的關系可以用土壤C:N來表示, 即土壤有機碳含量與全氮含量的比值, 它是土壤質量的敏感指標,它的演變趨勢對土壤碳、氮循環(huán)和植株的生長發(fā)育進程有重要影響。研究表明, 低的C:N可以加快微生物分解和氮的礦化速率, 高的C:N對土壤微生物的活動能力有一定的限制作用, 使有機質和有機氮的分解礦化速度減慢, 土壤固定有機碳的能力提高。,引言,當前,我國蘋果園土壤全氮含量達0.81.3gkg-1, 而有機碳含量不足1%, 再加上缺乏有效的管理措施, 造成了土壤C:N失調, 這是導致果園土壤質量退化、土壤微生物多樣性下降、土傳病害嚴重、果品產量品質下降的重要原因(。氮素和光合產物在蘋果生長發(fā)育、花芽分化及產量形成方面具有決定性作用, 而目前關于土壤C:N的研究主要集中在如何通過添加有機物質來提高土壤C:N和作物品質的研究上, 關于土壤C:N對蘋果植株生長及碳氮代謝特性的研究尚未見報道。為此, 本研究以生產上常用的蘋果砧木平邑甜茶(Malus hupehensis)為試驗材料, 研究了土壤C:N對平邑甜茶幼苗生長和氮素吸收、利用分配以及碳水化合物的運轉特性, 以期為蘋果生產上調節(jié)合理的土壤C:N提供理論依據。,砧木,砧木(rootstock)是指嫁接繁殖時承受接穗的植株。砧木可以是整株果樹，也可以是樹體的根段或枝段，有著固著、支撐接穗，并與接穗愈合后形成植株生長、結果。砧木是果樹嫁接苗的基礎，它嫁接親合性好，苗木壽命長，也容易繁殖。,接穗,砧木,平邑甜茶,用平邑甜茶作砧木所嫁接的蘋果品質好、壽命長，并有一定矮化作用，其性狀遠遠勝過其他砧木，專家們認為它是世界上最優(yōu)良的蘋果砧木。,1.材料和方法,1.1 試驗設計 試驗于2012年410月在山東農業(yè)大學園藝試驗站進行。供試土壤來自山東省煙臺市棲霞市蘇家店鎮(zhèn)小徐家村蘋果園, 通過大量采樣分析, 我們選取了6份具有不同土壤C:N、其他養(yǎng)分含量相近的土壤, 土壤類型為黏質壤土, 各處理土壤基本理化性質見表1。 試驗采用普通陶盆, 每盆裝風干土12 kg。于2012年3月26日, 選取長勢基本一致、無病蟲害的二年生平邑甜茶實生苗移栽入盆中, 待幼苗長勢平穩(wěn)后, 每個處理選取長勢基本一致的幼苗12盆進行試驗, 每盆1株。各處理中的12株植株分為2組, 每組6株。第1組: 于4月15日進行15N標記處理, 每株施入15N-尿素0.50 g (15N豐度為10.25%, 上?；ぱ芯吭荷a), 同時每株另施入硫酸鉀0.43 g、過磷酸鈣0.38 g。于9月18日對這6株植株進行13C脈沖標記。第2組: 每株施入普通尿素0.50 g、硫酸鉀0.43 g、過磷酸鈣0.38 g, 作為對照。各處理生長條件和栽培管理均保持一致。 13C脈沖標記在一個由透明農用地膜做成的標記室內進行(Lu et al., 2002), 標記前先檢查標記室的密封性(何敏毅等, 2008)。然后將風扇、平邑甜茶植株、還原鐵粉和13C豐度(13C在全部碳元素中所占比例)為98%的Ba13CO3 0.6 g放入標記室內, 將整個標記室密封。上午9:00開始標記, 先用注射器向裝有Ba13CO3的燒杯中注入一定量1 molL1的HCl溶液, 開動風扇, 標記開始。此后每隔0.5 h, 向燒杯中注入1次HCl, 以維持CO2濃度。標記時間持續(xù)4 h。標記結束后, 把植株放置于遠離其他未標記植株處, 以防呼吸產生的13CO2對其他植株造成污染。,1.材料和方法,1.材料和方法,1.2 測定項目和方法 13C脈沖標記完后的第3天(9月21日), 對所有處理進行破壞性采樣。植株解析為根、莖和葉3部分,樣品按清水洗滌劑清水1%鹽酸3次去離子水順序沖洗后, 105 下殺青30 min, 隨后在80 下烘干至恒重, 粉碎后過0.25 mm篩, 混勻后裝袋備用。13C豐度用DELTAplusXP型質譜儀(Thermo Electron GmbH, Bremen, Germany)測定, 15N豐度用ZHT-03 (北京分析儀器廠)質譜儀測定, 全氮用凱氏定氮法測定, 各器官干樣質量用1/1000電子天平稱量。,1.材料和方法,1.3 數據統(tǒng)計 (1) 13C豐度: Fi(%) = (13C + 1000) RPBD/ (13C + 1000) RPBD + 1000) 100, RPBD(碳同位素的標準比值) = 0.011 237 2; (2)進入各組分的13C量: 13Ci(mg) = Ci (FiFnl) / 100 1000, 式中Ci為各組分所含的碳量(g); nl表示未標記; (3) 13C在各器官的分配率: 13Ci(%) = 13Ci / 13C凈吸收 100; (4)植株器官從肥料中吸收分配到的15N量對該器官全氮量的貢獻率(Ndff%) = 植物樣品中15N原子百分超% / 肥料中15N原子百分超% 100; (5)氮肥利用率(%) = (Ndff 器官全氮量(g)/施氮量(g) 100, 式中Ndff(%) = 植物樣品中15N原子百分超% / 肥料中15N原子百分超%100; 原子百分超%樣品中15N豐度%自然豐度%; (6)氮肥分配率(%) =各器官從氮肥中吸收的氮量(g) / 總吸收氮量(g) 100。 用Excel 2003和SAS 9.0進行數據處理及統(tǒng)計分析, 用one-way ANOVA進行差異顯著性分析。,2.結果和分析,2.1 不同土壤C:N對平邑甜茶幼苗生長量和根冠比的影響 由表2可見, 不同土壤C:N處理下平邑甜茶幼苗的生物量存在顯著差異。,隨著土壤C:N的增大, 根系干重逐漸增加; 并且當土壤C:N處于低水平時(T1T3), 根系干重增加的幅度較大, T2比T1增加了5.89 g, T3比T2增加了6.19 g; 當土壤C:N增加到一定數值(T4)后, 根系干重小幅增加但差異不顯著,T5比T4增加了2.08 g, T6比T5增加了0.37 g。,從T1到T4處理, 株高、莖粗、地上部干重和植株總干重逐漸升高, 然后隨著土壤C:N的進一步增加而逐漸降低。,各處理的植株根冠比隨土壤C:N的增加呈現(xiàn)無規(guī)律變化, T1、T5和T6處理的根冠比均大于1, 三者間無顯著差異; T3和T4兩個處理的根冠比較低, 分別為0.85和0.87。,可見, 隨著土壤C:N的增加, 平邑甜茶幼苗根系生物量逐漸增大, 但當土壤C:N增加到一定值后, 將會對植株地上部的生長產生抑制作用。,2.結果和分析,2.2 不同土壤C:N對平邑甜茶幼苗15N利用率、各器官Ndff和15N分配率的影響 由表3可見, 土壤C:N顯著影響了平邑甜茶幼苗的15N利用率.,隨著土壤C:N的增加, 植株的15N利用率呈先升高后降低的變化趨勢。從T1到T4處理平邑甜茶幼苗的15N利用率逐漸升高, 由T1 處理的10.65%增加到T4處理的18.46%, T4處理是T1處理的1.73倍, 且各處理間差異顯著。隨著土壤C:N的進一步增加, 平邑甜茶幼苗的15N利用率逐漸降低, T5和T6處理分別比T4處理降低了1.59和2.58個百分點, T4與T5間差異不顯著, 但顯著高于T6處理?？梢? 土壤C:N太低或太高均不利于植株對外施氮肥的吸收。,器官的Ndff指植株器官從肥料中吸收分配到的15N量對該器官全氮量的貢獻率, 反映了植株器官對肥料15N的吸收征調能力。不同土壤C:N處理, 樹體吸收的15N在各器官間的分配規(guī)律不同(表3)。土壤C:N較低的兩個處理(T1和T2), 平邑甜茶幼苗各器官的Ndff大小順序為根葉莖, 而T3T6處理, 隨著土壤C:N的進一步增大, 葉片的Ndff均為最大, 其次是根, 莖最少, 表明當土壤C:N較低時, 根系對肥料氮的征調能力最強, 即樹體新吸收的氮主要用于根系的生長發(fā)育; 而當土壤C:N較高時, 葉片對肥料氮的征調能力最強, 這時樹體新吸收的氮主要用于地上部的生長發(fā)育。并且, T1處理植株各器官的Ndff均高于其他土壤C:N較高的處理, 表明當土壤C:N很低時, 植株主要利用肥料中的氮, 而土壤C:N較高時, 土壤和肥料中的氮均可被植株吸收利用。,各器官中15N占全株15N總量的百分率反映了肥料氮在樹體內的分布及在各器官遷移的規(guī)律。由表3可見, 隨著土壤C:N的增大, 葉片15N分配率逐漸增加, 而根系逐漸降低, 莖中無明顯變化。除了T1處理根中的15N分配率高于葉片外,其他處理均表現(xiàn)為葉根莖, 表明土壤C:N較低時,植株吸收的氮素主要分配至根系, 促進根系的生長發(fā)育; 當土壤C:N較高時, 則主要分配至地上部,用于地上部器官的構建。,2.結果和分析,2.3 不同土壤C:N對平邑甜茶幼苗各器官13C分配率的影響 13C分配率反映了葉片制造的光合產物在樹體各器官間的遷移規(guī)律。由表4可見, 不同土壤C:N處理平邑甜茶幼苗各器官間的13C分配規(guī)律一致: 葉最高(32.29%44.72%), 其次是莖(35.53%37.58%),根最低(19.75%31.67%)。 同一器官不同土壤C:N處理間13C的 分配率存在差異, 以葉和根最為顯著。 其中, 13C在葉中的分配率表現(xiàn)為隨土壤 C:N的升高而逐漸降低, T1處理(44.72%) 是T6處理(32.29%)的1.38倍; 而根中的 13C分配率與葉片表現(xiàn)出相反的變化規(guī) 律, 隨著土壤C:N的升高而逐漸升高, T6 處理最高(31.67%), T1處理最低(19.75%), T6處理是T1處理的1.60倍; 莖中的13C分配 率在不同土壤C:N處理間差異不大。,2.結果和分析,2.4 適宜土壤C:N的確定 植株生物量和氮素利用效率是評價植株生 長和氮素利用特性的重要指標。為確定本 試驗條件下的適宜土壤C:N, 我們將這兩個 指標與土壤C:N進行了擬合分析。由圖1可 見, 植株生物量和氮素利用效率與土壤 C:N的關系均呈拋物線狀, 即隨著土壤C:N 的升高, 這兩個指標均呈先升高后降低的 變化趨勢。通過對函數計算分析, 植株生 物量和氮素利用效率出現(xiàn)最大值時的土壤 C:N分別為21.29和23.11。因此, 綜合考慮 這兩個指標得出本試驗條件下平邑甜茶生長發(fā)育適宜的土壤C:N為2123。,3.討論,土壤C:N是土壤質量的敏感指標, 其值高低對土壤氮素轉化具有重要影響, 從而影響植株的生長發(fā)育進程。李雪利等(2011)在煙草上的研究表明, 土壤C:N在2428之間最有利于煙株生長過程中碳氮代謝和提高煙葉內在化學成分的協(xié)調性, 改善煙葉品質, 但當土壤C:N過高時則相反。劉世亮等(2007)的研究也表明, 適宜的土壤C:N有利于提高葉片葉綠素的含量和含氮量以及硝酸還原酶活性,而隨著C:N的進一步增大, 這些指標呈降低趨勢。本試驗中, 隨著土壤C:N的增大, 植株根系生物量逐漸增加, 而地上部生物量和植株總生物量則呈先升高后降低的變化趨勢, 以T4處理(土壤C:N = 19.96)樹體生物量最大, 但是當C:N大于T4處理后, 植株地上部生物量和植株總生物量有所降低,這與上述研究所得出的結論一致。 肥料氮素吸收利用效率也驗證了植株生物量的變化趨勢, 當土壤C:N為19.96 (T4)時植株對15N的利用率最高, 而隨著C:N的進一步增大, 肥料氮素利用率逐漸降低。這可能是因為C:N較高時, 土壤中的微生物大量繁殖, 而微生物的大量繁殖需要消耗一部分氮素, 就會出現(xiàn)微生物與植株共同競爭土壤中的氮素, 因此影響植株的生長和根系對養(yǎng)分的吸收; 而當土壤C:N較低時, 可供微生物利用的碳源較少, 微生物活性降低, 從而影響?zhàn)B分的有效性, 使得養(yǎng)分不利于被植株根系吸收, 進而抑制植株生長發(fā)育; 適宜的土壤C:N能夠限制土壤微生物的活動能力, 減慢有機碳和有機氮的分解礦化速度,有利于土壤有機碳的固存, 同時也不至于使土壤微生物對施入氮素的“固持”強度太高, 有利于充分發(fā)揮肥料氮的有效性, 促進植株對肥料氮的吸收利用。各器官的15N分配率反映了樹體新吸收的肥料氮在樹體各器官間的遷移規(guī)律不同, 本研究中隨著土壤C:N的增大, 葉片15N分配率逐漸增加, 而根系逐漸降低。表明土壤C:N較低時根系對氮的征調能力最強, 有利于根系的快速發(fā)育, 從而吸收更多的氮素來供應地上部分的生長, 這也是氮高效利用機制下根系的生理學反應之一; 而當土壤C:N較高時, 植株根系的生長狀良好, 現(xiàn)有的根系即可滿足植株對氮素養(yǎng)分的需求,不需要根系的過多生長, 而是將新吸收的肥料氮更多地轉運至地上部分, 用于地上部分器官的構建。,3.討論,根系吸收營養(yǎng)物質及營養(yǎng)物質向地上部運輸的能力, 以及葉片光合產物向根系運輸的速率與數量, 是導致樹體生長發(fā)育發(fā)生變化的主要原因。光合產物在樹體內的運輸、分配情況是影響果樹優(yōu)質、豐產、穩(wěn)產的重要因素。本研究采用13C同位素技術研究了光合產物的分配狀況, 結果表明同一器官在不同土壤C:N處理間13C的分配率不同, 其中尤以根和葉最為顯著。隨著土壤C:N的增大, 葉片制造的碳水化合物自留量減少, 增加了光合產物向根系的分配, 地上和地下營養(yǎng)交換較強, 使根系獲得了較多的能量, 從而提高了根系對礦質養(yǎng)分的吸收, 這也正是較高的土壤C:N條件下植株根系生物量和氮素利用率較高的原因所在。 除土壤C:N外, 土壤中其他養(yǎng)分的狀況也會影響植株的生長發(fā)育和碳氮代謝。為了保證試驗條件的唯一差異, 本試驗通過大量采樣分析(共測定了95個樣本), 選取了6份具有不同土壤C:N、其他養(yǎng)分含量相近的土樣作為試驗材料, 但所選土樣中的堿解氮、速效磷和速效鉀含量還是略有差別。雖然堿解氮、速效磷和速效鉀含量略有差別, 但我們認為造成本試驗中各處理間結果差異的主要因素是土壤C:N, 而并非堿解氮、速效磷和速效鉀, 原因主要有3點: 1)堿解氮、速效磷和速效鉀含量并不是隨著土壤C:N比的升高而逐漸增加的; 2)根據姜遠茂等(2007)和盧樹昌(2009)制定的果園養(yǎng)分分級標準,這6份土樣的堿解氮、速效磷和速效鉀含量均處于同一水平, 堿解氮含量均處于適宜水平, 速效磷含量均處于高水平, 速效鉀含量均處于適宜水平; 3)將試驗結果與各處理土壤的所有參數進行多元線性分析后表明造成結果差異的主要因素是土壤C:N比, 而堿解氮、速效磷和速效鉀與各個指標的相關性很小。,3.討論,綜合土壤C:N對蘋果植株生長及碳氮代謝狀況來看, 土壤C:N太高或太低時均不利于植株生長和氮素吸收, 也影響了葉片制造的碳水化合物在地上部分和地下部分之間的交換, 進而影響了根系功能。通過對植株生物量和氮素利用效率與土壤C:N進行擬合分析, 兩者出現(xiàn)最大值時的C:N分別為21.29和23.11。植株生物量由地上部分和根系兩部分組成, 隨著土壤C:N的增加, 植株生物量和根系生物量均逐漸增加, 而當根系生物量較高, 即根冠比較大時, 會影響地上部分的生長, 從而造成植株總生物量的降低; 而當根系生物量較大時, 有利于根系對土壤中氮素的吸收, 因此植株生物量和氮素利用效率出現(xiàn)最大值時的土壤C:N有所差異。因此, 綜合考慮植株生物量和氮素利用效率, 得出本試驗條件下適宜的土壤C:N為2123, 在此范圍內, 既能促進植株的生長發(fā)育, 又可以提高氮素利用率和光合產物在地上部分和地下部分的交換能力。本試驗是在盆栽條件下進行的,由于空間的局限會影響根系的生長, 因此大田條件下蘋果植株對土壤C:N的反應仍需進一步研究。同時, 本試驗所采用的土壤類型為壤土, 而不同類型的土壤由于其自身通氣性及持水保肥能力的不同也會影響植株對土壤C:N的反應, 比如沙土的通氣性較好, 但保水保肥能力較弱, 因此可能需要較高的土壤C:N來為根系創(chuàng)造最優(yōu)的生長空間。所以, 其他土壤類型下適宜于蘋果植株生長發(fā)育的土壤C:N的確定仍需深入研究。因此, 在土壤類型為壤土的蘋果園生產上應用生物秸稈或者其他外源碳來提高果園土壤C:N時, 要根據土壤氮素水平狀況, 調整外源碳的添加量, 控制土壤C:N處于2123, 從而達到高產、優(yōu)質、高效的目的。,Black Spot: a platform for automated and rapid estimation of leaf area from scanned images 黑點：通過掃描圖像對葉面積自動快速估計的平臺,Varun Varma Anand M. Osuri Plant Ecology (2013) 214:15291534,摘要-Abstract,葉面積及其衍生物（如特定葉面積）被廣泛應用于生態(tài)評估，尤其是在動植物相互作用、植物群落組成、生態(tài)系統(tǒng)功能和全球變化研究等領域。因為規(guī)模檢測和葉面數字化都需要手動輸入，即使使用專門的軟件處理掃描的葉片圖像，葉面積的估算依然非常耗時。我們引進了黑點面積計算器（Black Spot Leaf Area Calculator）（以下簡稱黑點），這是一種對標準平板式掃描儀拍攝的葉片圖像進行自動快速評估的獨立軟件。黑點對顏色波段比值作綜合的劃分，從而對葉片表面和圖像背景進行基于像素的分類。值得注意的是，該軟件從圖像數據中提取信息來檢測圖像尺寸，從而省去了耗時的手動校準。黑點給用戶提供了葉面積的估算值及將圖像分類以便進行錯誤檢驗。我們收集了51種不同的植物的100組葉片，來測試這種方法的實際應用。用黑點估算葉面積與用圖像編輯軟件手動處理圖像得到了統(tǒng)計學上的相同結果。用黑點估算葉面積相對手動處理的平均誤差率為-0.4%（標準差=0.76）。黑點的主要優(yōu)點是能夠以最少的人力和較低的成本快速批量處理多物種的數據集，從而成為生態(tài)學領域的一個有價值的工具。,引言-Introduction,單個葉片的表面積在植物科學研究中是個重要屬性。葉面積與植物適應生長環(huán)境和資源的生理過程密切相關，并普遍應用于生態(tài)學、全球變化生物學和農業(yè)學。葉面積進一步用于導出生態(tài)系統(tǒng)和生態(tài)功能中廣泛使用的度量標準。例如，植物的功能性狀特定葉面積 (SLA = 葉面積/葉干重)與植物的生長策略密切相關，并定義了植物在基本資源采集-資源存儲軸中的位置。SLA可以看做變量，因此需要大的樣本規(guī)模使估計更可靠。 雖然我們都知道估計葉面積在各種生態(tài)評估中是重要的，但數據收集需要較長的時間和較多的精力。葉輪廓在沒有計算機的時代是手繪于坐標紙上的，更加現(xiàn)代的方法是利用專門的設備 （例如LI-C或LI-3000 C 便攜式葉面積儀），或數字圖像處理軟件加上低預算的硬件，例如桌面掃描儀來估計葉面積。大多數現(xiàn)有軟件的基本操作程序包括 (1) 處理葉片圖像使其與背景分離，(2) 使用已知尺寸的物體（例如尺）的圖像創(chuàng)建一個校準刻度， (3) 用葉象素計數和校準刻度推斷葉面積。在執(zhí)行這些步驟時，使用的軟件有不同的作用，葉片數字化和校準步驟需用戶操作。從圖像背景中區(qū)分出葉像素要么需要完整的手動處理，要么需要手動指定像素強度閾值，要么使用半自動化的標準的圖像處理軟件。 一些更復雜和專業(yè)的應用程序使用基于葉片光譜特性的算法自動提取葉前景，例如低值的藍光帶反射，并用分割法來檢測多邊形的葉邊界。然而，這些軟件仍然需要手動步驟分配圖像比例，應用光譜規(guī)則校準對小規(guī)模物種工作的準確性。因此，批量處理大型，多種類的數據集是不可能的。,引言- Introduction,我們介紹的黑點，是一個獨立免費的軟件平臺，能快速自動地進行葉片圖像處理并對葉片掃描圖像進行葉面積估算。黑點這個名字讓我們想起了早期版本的軟件，這種軟件需要用戶從包含用于校準比例的已知黑色區(qū)域的背景中將葉片分辨出來（在當前版本中不需要這種黑色區(qū)域）。開發(fā)黑點的目的是 (1)給野外工作的生態(tài)學家提供高效又符合成本效益的批量處理工具，來迅速地處理葉圖像的大量多物種數據集，(2) 盡量減少估算時用戶的輸入量來減少工作時間，(3) 輸出易于統(tǒng)計分析的數據，(4) 輸出用戶錯誤檢查時所需的足夠信息。,黑點的開發(fā)- Development of Black Spot,黑點要求用戶在掃描葉片圖像時使用普通白紙作為背景。該軟件使用基于圖像波段比值（ image band ratios ）（而不是像素強度）的光譜規(guī)則集進行基于像素的分類，將每個圖像分為葉 （前景） 和非葉 （背景） 兩部分。規(guī)則集的基本原則如下：（a）白色背景與紅、綠、藍光波段有相同的反射率，從而使背景的波段比值趨近于1；(b) 新鮮葉子吸收部分入射光 （例如綠色葉片有高的紅光吸光度），從而導致在一個反射波段比值中產生很強偏差。重要的是，使用波段比值可使軟件減少因圖像中陰影的存在導致的誤差（這里我們假設陰影會導致像素強度的降低，使波段相對強度之間沒有太大差別）。因此，落在白色背景上的葉片陰影，即使強度降低了，但仍與白色背景有相同的波段比值，而葉片上的葉片陰影可以被分離出來（這在掃描褶皺的葉片時是一個常見問題）。 基于波段比值的光譜分類規(guī)則集已經被開發(fā)并使用包含800個圖像的多物種圖像數據庫進行校準。在撰寫本文時，黑點已經為佳能和惠普掃描儀內置了光譜規(guī)則集（以下測試機型：HP SCANJET G3110，HP Deskjet F4488，Canon LiDE 110和Canon LiD E25）。在這些規(guī)則的開發(fā)中，我們觀察到不同品牌掃描儀在葉片圖像的光譜特性上具有一致性，這可能是相似的圖像獲取和處理技術導致的。因此，我們相信這些光譜規(guī)則集可以在各種品牌機型中廣泛應用。,運行黑點- Running Black Spot,步驟1：獲取葉片圖像 在此過程中，使用平板掃描儀掃描新鮮葉子并以.jpg格式（圖 1a、 b）保存。在此掃描步驟中，建議用戶在掃描儀內蓋粘貼白紙片，以防止對掃描儀內蓋永久染色。這張白紙片還作為一個容易識別的背景，因此應無任何注釋或標記。根據所需數據的分辨率，葉片樣品可包括單片葉子或一種植物的一組葉子。所有掃描的圖像必須存儲在單個文件夾便于用黑點處理。黑點用戶手動為多個物種情況下（如大型葉片，具有特別厚的葉柄和葉軸的葉片，以及復合葉片）的葉片掃描提供詳細的指引。,運行黑點-Running Black Spot,運行黑點- Running Black Spot,步驟2：運行黑點，用戶輸入 掃描完成后，黑點開始估算獲取葉片的葉面積。處理圖像之前，用戶需要輸入以下信息：（1）保存葉片圖像的文件夾的路徑；（2）保存輸出結果的文件夾的名字；（3）所需平滑篩選器（ smoothening filter）的大?。? x 3，5 x 5，7 x 7，9 x 9像素）；（4）分析時需要去除的圖像邊緣寬度。平滑篩選器（step 3）的作用是糾正可能引起噪點產生的人為因素。對于一個300 dpi（鼠標的DPI是每英寸點數，也就是鼠標每移動一英寸指針在屏幕上移動的點數）圖像，窗口大小選擇可從0.25mm的3 x 3窗口到0.8mm的9 x 9窗口。給用戶提供的窗口選擇只有奇數，是為了焦點像素的對稱性，大小不超過9 x 9是為了防止葉面積估算的準確性降低。去除圖像邊緣（step 4）是為了校正圖像獲取時易產生的誤差（由光泄露到掃描區(qū)域產生，一般表現(xiàn)為在圖像邊緣周圍變暗）。最后，在輸入較大圖像時，用戶可調整其大小。做完這些步驟，黑點開始處理圖像。,運行黑點- Running Black Spot,步驟3：圖像處理 圖2是黑點工作的流程示意圖。輸入文件夾中的每個圖像是按順序處理的。首先，根據用戶的輸入 （階段 2），調整圖像的大小、去除圖像邊緣。然后，每個圖像的可交換圖像文件格式 (exchangeable image file format， exif) 信息被提取出來。Exif 信息包含獲取葉片圖像的掃描儀品牌以及圖像獲取時的像素分辨率。后者被記錄為dpi，并在平板掃描儀中直接轉換成圖像比例。根據使用的掃描儀品牌，軟件應用適當的光譜規(guī)則集將葉片從背景識別出來。 第一次進行基于像素分類后，用降噪篩選器（ de-speckling filter ）（其大小已有用戶指定）處理分類圖像。分類和篩選過程產生一個二值圖像（葉和非葉），從而確定葉片像素數目。之后利用從圖像的EXIF數據中提取像素分辨率值計算葉面積（cm2）。,運行