化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)傳染病

1、化學(xué)發(fā)光法快速檢測(cè)傳染病,更靈敏、更特異、更準(zhǔn)確,放免,酶聯(lián)免疫,化學(xué)發(fā)光,熒光免疫,60年代,70年代,80年代,90年代,免疫標(biāo)記技術(shù)發(fā)展,國產(chǎn),進(jìn)口,酶促化學(xué)發(fā)光,直接化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用前景,.敏感度高，(10-21mol/L)超過酶免，熒光免疫等方法 .精密度，準(zhǔn)確度超過放免，酶免，熒光免疫等方法 .試劑穩(wěn)定，無放射性，污染或生物毒性； .測(cè)定耗時(shí)短，方便快速提供結(jié)果報(bào)告； .測(cè)定項(xiàng)目齊全； 已發(fā)展成全自動(dòng)的測(cè)定系統(tǒng)。,包被技術(shù)的發(fā)展-磁微粒子,包被磁微粒 標(biāo)記異魯米諾,Eg:雙抗夾心法分析模式 磁微粒子上包被的抗體與待檢測(cè)抗原及異魯米諾標(biāo)記抗體結(jié)合,提升檢測(cè)功能靈敏度

2、 增加檢測(cè)線性范圍 比吖啶酯更穩(wěn)定 延長(zhǎng)試劑效期,*,*,*,*,*,*,*,*,*,*,微粒包被,液相反應(yīng),磁微粒、直接化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 反應(yīng)充分 速度更快,酶標(biāo)板，板式,磁微粒，納米級(jí)，均相,CLIA,板式載量,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,磁微粒子 直接化學(xué)法 Ag/Ab,酶標(biāo)板 發(fā)光板 Ag/Ab,微粒子化學(xué)發(fā)光法抗體載量?jī)?yōu)勢(shì),微粒子化學(xué)發(fā)光原理,磁性微粒子及其分離技術(shù),磁性微粒子技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)： 快速分離結(jié)合相與游離相 提高與Ag或Ab包被親和力 提高接觸表面積/反應(yīng)容量比例，實(shí)現(xiàn)微量分析 不需要抗體分離步驟，杜絕干擾與交叉反應(yīng) 允許共價(jià)耦合反應(yīng)，因此可以檢測(cè)大/小分子的各種物質(zhì)成分

3、能應(yīng)用各種分析設(shè)計(jì)與反應(yīng)模式，擴(kuò)大應(yīng)用范圍 如：夾心法，竟?fàn)幏ǎ贵w檢測(cè)法等 利于檢測(cè)自動(dòng)化與微量分析,磁微粒子直接化學(xué)發(fā)光是最新一代免疫檢測(cè)新技術(shù) 具有液相、快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn) 通過多中心的臨床評(píng)估，基本上驗(yàn)證了LICA在乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、腫瘤標(biāo)志物、甲狀腺功能等項(xiàng)目的臨床可用性 多家臨床試驗(yàn)顯示產(chǎn)品的質(zhì)量不亞于進(jìn)口的雅培、羅氏和西門子等廠家的產(chǎn)品媲美。,1）磁性微粒子技術(shù)： 便于分離，反應(yīng)均勻，提高靈敏度 2）泉涌?jī)?nèi)外壁清洗技術(shù)： 最小的交叉污染率 3）試劑盒蓋設(shè)計(jì)： 減少人工操作誤差和交叉污染，避免試劑揮發(fā)影響結(jié)果準(zhǔn)確性 4）試劑冷藏系統(tǒng)： 保證在儀器操作的過程中試劑能夠一直保

4、持穩(wěn)定 5）磁性分離技術(shù)： 保證了清洗效率，對(duì)于靈敏度要求極高的標(biāo)記免疫分析是十分關(guān)鍵的,技術(shù),雅培 免疫項(xiàng)目,甲狀腺功能 甲狀腺素 三碘甲狀腺原氨酸 游離甲狀腺素 游離三碘甲狀腺原氨酸 促甲狀腺素 性腺激素 人絨毛膜促性腺激素 催乳素 雌二醇 卵泡刺激素 黃體生成素 孕酮 睪酮,腫瘤標(biāo)志物 甲胎蛋白 癌胚抗原 前列腺特異性抗原 游離前列腺特異性抗原 糖類抗原125 糖類抗原15-3 糖類抗原19-9 2微球蛋白 鐵蛋白 神經(jīng)元特異性烯醇化酶 人鈣結(jié)合蛋白 腫瘤相關(guān)抗原72-4 鱗狀上皮癌相關(guān)抗原 細(xì)胞角蛋白CYFRA 21-1,心血管及心肌標(biāo)志物 N末端腦鈉肽 肌鈣蛋白 肌酸激酶同工酶 C反

5、應(yīng)蛋白 心肌脂肪酸結(jié)合蛋白 脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2 髓過氧化物酶 肌紅蛋白 肝纖維化四項(xiàng) 透明質(zhì)酸 型前膠原N端肽 型膠原蛋白 層粘連帶白,傳染病 乙型肝炎病毒前S1抗原 乙型肝炎病毒e抗體 乙型肝炎病毒e抗原 乙型肝炎病毒核心抗體 乙型肝炎病毒表面抗體 乙型肝炎病毒表面抗原 丙型肝炎抗體（HCV） 梅毒抗體（TP） 人類免疫缺陷病毒抗體 糖代謝類 胰島素 C-肽,全自動(dòng)、管式、直接化學(xué)發(fā)光法 -特異性強(qiáng)、性能穩(wěn)定 超長(zhǎng)時(shí)間無人值守 （1）試劑區(qū)15個(gè)試劑位， （2）樣本區(qū)12 12 = 144 個(gè)樣本位 （3）碼垛區(qū)一次性裝載720個(gè)反應(yīng)杯 測(cè)試中可隨時(shí)添加，隨時(shí)替換,真正的急診功能，急診樣本

6、，隨到隨測(cè)。 測(cè)試速度高達(dá)220測(cè)試/小時(shí) 原試管上樣，無需倒管。 全封閉反應(yīng)艙，有效減少外界環(huán)境干擾和污染 全中文軟件，圖標(biāo)式界面，操作更簡(jiǎn)便 綜合測(cè)試成本低,管式、微粒子包被技術(shù)，反應(yīng)速度更快，結(jié)果更準(zhǔn)確。 ELISA法檢測(cè)乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照2010年藥典規(guī)定反應(yīng)時(shí)間至少要2小時(shí)30分鐘；而全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光試劑則不到30分鐘即可完成。 穩(wěn)定性更好 特異性更好,大部分國際一流廠家也都采用直接發(fā)光法：,羅 氏 西門子 雅 培 .,傳染病試劑傳統(tǒng)酶免法和微粒子化學(xué)發(fā)光法對(duì)比,參比試劑：雅培I2000,試劑性能多中心臨床評(píng)估（乙肝）,免疫測(cè)定試劑的關(guān)鍵點(diǎn),作為免疫反應(yīng)，抗原抗體

7、的選擇是整個(gè)免疫分析特異性和總體表現(xiàn)的關(guān)鍵 如何選擇好一個(gè)抗體(單克隆或多克隆)去檢測(cè)一個(gè)被檢物質(zhì)，而不與非常相似結(jié)構(gòu)的其它代謝產(chǎn)物有交叉反應(yīng),或著是一些沒有臨床意義的分解產(chǎn)物等，這是分析設(shè)計(jì)的重點(diǎn)中之重點(diǎn)。 批內(nèi)、批間的分析重現(xiàn)性。,AFP,HBsAg,4.50%,1.79%,4.91%,2.14%,批內(nèi),批間,微粒子化學(xué)發(fā)光試劑的精密度,參比試劑：雅培,試劑性能多中心臨床評(píng)估,N=500， 參比試劑：雅培I2000,試劑性能多中心臨床評(píng)估,丙型肝炎抗體診斷試劑,丙肝病毒復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)： 決定了抗體譜的差異，從而為丙肝抗體檢測(cè)敏感度的提高帶來了困難。,丙肝診斷試劑目前存在的問題,1、灰區(qū)標(biāo)本

8、的困惑 2、陽性標(biāo)本的漏檢,問題形成的技術(shù)原因-灰區(qū)的形成,1、重組抗原的原因 （1）融合蛋白 （2）大腸桿菌雜蛋白 2、第二抗體的非特異反應(yīng) （1）酶標(biāo)抗體對(duì)固相載體的直接吸附 酶標(biāo)二抗對(duì)于丙肝抗體是非特異的，和各種人IgG均能反應(yīng)結(jié)合。 （2）個(gè)別標(biāo)本中IgG濃度過高 多聚體的混合：E-E、E-Ab、E-Ab-E、E-Ab-E-Ab ，既引起本底背景，又阻遏抗原抗體反應(yīng),問題形成的技術(shù)原因-陽性標(biāo)本的漏檢,1、關(guān)于靈敏度的兩個(gè)概念 （1）分析靈敏度 決定因素： a.單個(gè)抗原決定族的抗原性強(qiáng)弱。 b.試劑盒的信號(hào)放大能力 （2）流行病學(xué)敏感度 決定因素： a.抗原片段的種類是否齊全。 b.是

9、否含構(gòu)像抗原。 c.分析靈敏度的高低。,丙型肝炎病毒的基因結(jié)構(gòu),ELISA-1st RIBA-1st,ELISA-2st RIBA-2st,ELISA-3st RIBA-3st,2、抗原片段種類不全,3、包涵體抗原，抗原性弱 4、缺乏構(gòu)像表位 5、原核表達(dá)分子量小，抗原表位有限 6、抗原非糖基化，穩(wěn)定性差 7、信號(hào)放大能力有限 8、固相載體形成的空間位阻,問題形成的技術(shù)原因-陽性標(biāo)本的漏檢,新型丙肝化學(xué)發(fā)光試劑的關(guān)鍵技術(shù),1、包被和標(biāo)記實(shí)現(xiàn)雙特異，以降低假陽性率，并提高分析敏感度。 2、通過整體系統(tǒng)優(yōu)化，進(jìn)一步擴(kuò)大陰陽反差，使結(jié)果判讀涇渭分明。,新型丙肝化學(xué)發(fā)光試劑技術(shù)策略-灰區(qū)的解決,1、酵

10、母真核表達(dá)抗原，高效減少灰區(qū)標(biāo)本 eg: E.coli與Pichia pastoris 檢測(cè)國標(biāo),Anti HCV重組 NS3 抗原,NS3 HCV病毒的最重要的抗原 通過酵母真核系統(tǒng)成功的表達(dá)NS3抗原, 多重折疊以達(dá)到高度的免疫活性 高純度; 易于直接標(biāo)記,2、針對(duì)Fab端的單特異性抗體標(biāo)記物一般二抗和單特異抗體的對(duì)比,3、板式固相載體升級(jí)為管式磁微粒子包被 包被量更富足 管式液相反應(yīng)更充分 更有效的解決空間位阻效應(yīng),4、光信號(hào)檢測(cè)，提高信噪比 信號(hào)放大代替靶標(biāo)放大，減少靶標(biāo)放大帶來的非特異性反應(yīng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ELISA的信噪比。,新型丙肝化學(xué)發(fā)光試劑-降低漏檢率,1、在CORE、NS3、NS

11、4、NS5的基礎(chǔ)上增加了E1區(qū)，保證抗原片段的齊全 2、pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)帶來以下優(yōu)勢(shì) （1）非包涵體而可溶性表達(dá)，抗原性強(qiáng) （2）因糖基化而提高穩(wěn)定性 （3）分子量大，抗原表位豐富 （4）具有構(gòu)像抗原表位，而提高檢出率 3、磁微粒子標(biāo)記抗原增加抗原抗體的反應(yīng)強(qiáng)度,新型丙肝化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)國家參考品符合率對(duì)比,新型雙特異丙肝化學(xué)發(fā)光診斷試劑臨床驗(yàn)證報(bào)告,丙肝化學(xué)發(fā)光試劑臨床對(duì)比試驗(yàn)報(bào)告,對(duì)照試劑：雅培I2000SR 試驗(yàn)單位：包頭市中心醫(yī)院,RIBA試驗(yàn)結(jié)果：陰性。,定性檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果判讀-有反應(yīng)性和無反應(yīng)性,定性項(xiàng)目一般以陰陽性作為結(jié)果判斷的基礎(chǔ)。 陰陽性判讀基于量化的結(jié)果

12、，主觀進(jìn)行陰陽性的定義。 真正的確認(rèn)的陰陽性需要通過金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法才能確證。 HCV的確證實(shí)驗(yàn)RIBA（重組免疫印跡法） HIV的確證實(shí)驗(yàn)Western-Blot（蛋白質(zhì)印跡法） 感染初期，可能使用確證實(shí)驗(yàn)也無法得出準(zhǔn)確的陰陽性結(jié)論。 檢驗(yàn)方法的局限性，使用有反應(yīng)性和無反應(yīng)性來評(píng)估該樣本針對(duì)該檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果。 半定量檢測(cè)，通過病員的動(dòng)態(tài)隨訪，相隔一定時(shí)間再行檢測(cè)，可通過S/CO值的變化程度來進(jìn)行確證。,高特異 經(jīng)典免疫學(xué)原理，單克隆抗體技術(shù) 大分子采用夾心法分析 小分子采用競(jìng)爭(zhēng)法分析 專利的磁性分離技術(shù),高靈敏 采用最靈敏、最穩(wěn)定的直接發(fā)光級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng) 采用最持久最穩(wěn)定的發(fā)光劑ABEI 采用磁性微粒子技術(shù)，擴(kuò)大包被面積,高穩(wěn)定 發(fā)光信