第三章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

1、.,1,第十一章抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝,主講教師：生科院洪軍,.,2,制藥微生物生產(chǎn)菌種如何選育？發(fā)酵過(guò)程中主要檢測(cè)的參數(shù)有哪些？ 發(fā)酵工藝過(guò)程如何控制？,知識(shí)回顧,.,3,主要內(nèi)容,抗生素的概述： （1）抗生素的定義 （2）抗生素的命名 （3）抗生素的分類(lèi) 青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)工藝：（重點(diǎn)） （1）青霉素的概述 （2）生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性 （3）發(fā)酵工藝過(guò)程,.,4,1 抗生素的定義和命名 （1）抗生素的定義,早期：一般認(rèn)為來(lái)源于微生物，且主要作用于細(xì)菌感染。故認(rèn)為抗生素(antibiotics)是微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)的，在低濃度下就能抑制它種微生物生長(zhǎng)和活動(dòng)，甚至殺死他種微生物的化學(xué)物質(zhì)。由于抗生素

2、的這種殺菌能力，我們?cè)?jīng)把這類(lèi)物質(zhì)叫做抗菌素。,.,5,現(xiàn)在： 來(lái)源：隨著抗生素研究和生產(chǎn)的發(fā)展，新的抗生素的來(lái)源正在擴(kuò)大?？梢允俏⑸?、植物（如蒜素、常山堿、黃連素、長(zhǎng)春花堿、魚(yú)腥草素等） 、動(dòng)物（如魚(yú)素、紅血球素等） 。但抗生素的工業(yè)化生產(chǎn)主要是來(lái)自微生物的大量發(fā)酵法，微生物是抗生素舞臺(tái)上的主角。 作用對(duì)象：病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、寄生蟲(chóng)、藻類(lèi)、腫瘤細(xì)胞等。因此不能把抗生素僅僅作為抗菌藥物。,.,6,定義：雖然抗生素已被廣泛使用，但是由于抗生素的多樣性，關(guān)于抗生素的定義在專(zhuān)家中一直存在著分歧。 目前，一個(gè)大多數(shù)專(zhuān)家所接受的定義是：抗生素是由生物（包括某些微生物、植物和動(dòng)物在內(nèi)）在其生命

3、活動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的或（化學(xué)合成獲得的），能在低濃度下有選擇地抑制他種生物機(jī)能的低分子量的有機(jī)物質(zhì)。 狹義的定義是：抗生素是低分子量的微生物代謝產(chǎn)物，能在很低的濃度下抑制其他微生物的生長(zhǎng)。,.,7,按生物的來(lái)源：凡是在動(dòng)、植物或微生物產(chǎn)生的，可按來(lái)源命名。如青霉素、赤霉素、蒜素 按化學(xué)結(jié)構(gòu)命名：化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)清楚的，如四環(huán)素（含有四并苯的基本母核），氯四環(huán)素（金霉素），氧四環(huán)素（土霉素）。,其它：紀(jì)念意義、產(chǎn)地、俗名如正定霉素、井岡霉素、金霉素和土霉素等。,（2）抗生素的命名（一般分為三類(lèi)）,.,8,natural penicillin R =,CH2-CO-,.,9,-內(nèi)酰胺 環(huán),苯甲異噁唑青霉素

4、,氨 芐青霉素,羧芐青霉素,苯氧甲基青霉素,.,10,2 抗生素的發(fā)展簡(jiǎn)史,2.1治療和發(fā)展 我國(guó)的發(fā)展： 1953年5月1日，建立了第一個(gè)生產(chǎn)青霉素的抗生素工廠（上海第三制藥廠）； 1958年6月3日，最大的抗生素聯(lián)合企業(yè)建成投產(chǎn)（華北制藥廠,石家莊），也是青霉素發(fā)酵總?cè)莘e居世界首位。 目前，多為原料藥基地。但在半合成及成品藥的劑型方面與國(guó)外相比差距很大。,.,11,抗生素濫用的重災(zāi)區(qū),中國(guó)是抗生素使用大國(guó)，也是抗生素生產(chǎn)大國(guó)：年產(chǎn)抗生素原料大約21萬(wàn)噸，出口3萬(wàn)噸，其余自用（包括醫(yī)療與農(nóng)業(yè)使用)，人均年消費(fèi)量138克左右(美國(guó)僅13克)。 2011年4月7日是世界衛(wèi)生日，首屆合理用藥大會(huì)在

5、這一天召開(kāi)，恰好契合了世界衛(wèi)生日的主題“抵御耐藥性：今天不采取行動(dòng)，明天就無(wú)藥可用”。,.,12,“后抗生素時(shí)代”,如果不再控制抗生素的濫用狀態(tài)，二十一世紀(jì)人類(lèi)有可能失去抗生素這個(gè)有利的治療武器，重新回到?jīng)]有抗生素的時(shí)代，所謂“后抗生素時(shí)代”。 后抗生素時(shí)代是倒退，我們可能回到?jīng)]有藥物可使用的狀態(tài)，大量的傳染性疾病將危害人類(lèi)的身體健康和生命。雖然這是一種悲觀的想法，但悲觀的很有道理，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥速度比新藥物開(kāi)發(fā)的速度快得多，這是一個(gè)確實(shí)的現(xiàn)象。,.,13,3 抗生素的分類(lèi),可根據(jù)生物來(lái)源、作用對(duì)象、化學(xué)結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、生物合成途徑等方面對(duì)抗生素進(jìn)行分類(lèi)。 3.1 根據(jù)抗生素的生物來(lái)源分類(lèi) (生

6、物學(xué)家) （1）放線菌產(chǎn)生的抗生素：如鏈霉素、四環(huán)類(lèi)（如四環(huán)素）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（如紅霉素）、多烯類(lèi)（如制霉菌素） 、放線菌素類(lèi)（如放線菌素D）等。（其中鏈霉菌屬最多，諾卡氏菌屬、小單孢菌次之） （2）真菌產(chǎn)生的抗生素：如青霉菌屬和頭孢菌屬等分別產(chǎn)生一些很重要的抗生素（青霉素、灰黃霉素、頭孢菌素）。,.,14,（3）細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：如多粘桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌等。如多粘菌素。 （4）植物或動(dòng)物產(chǎn)生的抗生素：從被子植物蒜中制得的蒜素；從動(dòng)物臟器中制得的魚(yú)素等。 3.2根據(jù)抗生素的作用對(duì)象分類(lèi)（醫(yī)生、病理學(xué)家） （1）廣譜抗生素：如氨卞青霉素既抑制G+，又抑制G- （2）抗G+的抗生素：如青霉素，

7、 （3）抗G-的抗生素：如鏈霉素 （3）抗真菌的抗生素：如制霉菌素 （4）抗病毒的抗生素：如四環(huán)類(lèi)抗生素對(duì)立克次氏體及較大病毒有一定作用。 （5）抗癌的抗生素：如阿霉素,.,15,3.3根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)（化學(xué)家） 較復(fù)雜，目前已確定結(jié)構(gòu)的抗生素習(xí)慣如下分類(lèi)： （1）-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素：包括青霉素類(lèi)，頭孢菌素類(lèi)等 （2）氨基糖苷類(lèi)抗生素：包括鏈霉素、慶大霉素等 （3）大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)抗生素：如紅霉素、麥迪加霉素 （4）四環(huán)類(lèi)抗生素：如四環(huán)素、土霉素 （5）多肽類(lèi)抗生素：如多粘菌素、桿菌肽 （6）蒽環(huán)類(lèi)抗生素：如阿霉素、柔紅霉素 （7）喹諾酮類(lèi)抗生素：如環(huán)丙沙星、諾氟沙星,.,16,3.4 根據(jù)作

8、用機(jī)制分類(lèi) 此種分類(lèi)的優(yōu)點(diǎn)：便于進(jìn)行理論研究，有助于了解抗生素影響病原體新陳代謝的哪些環(huán)節(jié)，從而找出治療的規(guī)律，使抗生素的使用更為合理。 （1）抑制細(xì)胞壁合成的抗生素：如青霉素。 （2）影響細(xì)胞膜功能的抗生素：多烯類(lèi)抗生素。 （3）抑制病原菌蛋白質(zhì)合成的抗生素：四環(huán)素。 （4）抑制核酸合成的抗生素：如影響DNA結(jié)構(gòu)和功能的絲裂霉素C。 （5）抑制生物能作用的抗生素：如抑制電子轉(zhuǎn)移的抗霉素。,.,17,.,18,3.5 根據(jù)抗生素的合成途徑分類(lèi) （1）氨基酸、肽類(lèi)衍生物抗生素：如青霉素類(lèi)、頭孢菌素等寡肽抗生素。 （2）糖類(lèi)衍生物抗生素：如鏈霉素等糖苷類(lèi)抗生素。 （3）以乙酸、丙酸為單位的衍生物抗

9、生素：紅霉素等丙酸衍生物。,.,19,生產(chǎn)方法： 1、生物合成法： 傳統(tǒng)方法 “工程菌”制造法 細(xì)胞融合技術(shù)法 2、化學(xué)合成法； 3、生物合成加化學(xué)合成法。,4 抗生素的生產(chǎn)工藝,.,20,1、生物合成法： 傳統(tǒng)方法 大多數(shù)抗生素是由放線菌和霉菌產(chǎn)生的。菌種是通過(guò)從土壤中分離、篩選獲得，一般采用深層通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐生產(chǎn)。 傳統(tǒng)方法目前存在很多不足，因此，人們采用基因工程和細(xì)胞融合技術(shù)，對(duì)抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行了改造和重新設(shè)計(jì)，不僅可以制造出許多高效低毒的新型抗生素，還可改革工藝，使抗生素產(chǎn)量成倍地增長(zhǎng)。,.,21, “工程菌”制造法 第一次由“工程菌”制造的全新抗生素麥迪紫紅素A，是美國(guó)報(bào)道的。他們將

10、產(chǎn)放線紫紅素的部分基因插入產(chǎn)麥迪霉素的放線菌中，構(gòu)建的“工程菌”產(chǎn)生了全新的抗生素。 我國(guó)新構(gòu)建的生產(chǎn)丁胺卡那霉素的“工程菌”，就是把?；富蚩寺〉娇敲顾禺a(chǎn)生菌中獲得的。新的“工程菌” 生產(chǎn)的新抗生素毒副作用小，對(duì)耐卡那霉素、慶大霉素致病菌臨床療效顯著。,.,22,細(xì)胞融合技術(shù)法 對(duì)抗生素產(chǎn)生菌采用細(xì)胞融合技術(shù)的成果更為突出。橄欖色無(wú)孢小單孢菌細(xì)胞融合株抗生素產(chǎn)率比原菌株提高140倍。 目前DNA重組技術(shù)已廣泛用于紅霉素、鏈霉素等20多種抗生素的育種工作，可以預(yù)見(jiàn)不久將來(lái)會(huì)有更多的由“工程菌”生產(chǎn)的新型抗生素問(wèn)世。,.,23,2、化學(xué)合成法 根據(jù)某種抗生素的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，通過(guò)化學(xué)合成的方

11、法，可生產(chǎn)部分抗生素。 如：氯霉素、磷霉素等。 經(jīng)過(guò)化學(xué)合成方法和控制條件的不斷深入研究，越來(lái)越多的抗生素可用化學(xué)合成法生產(chǎn)。,.,24,3、生物合成加化學(xué)合成法 許多細(xì)菌逐漸出現(xiàn)了抗藥性，已經(jīng)證實(shí)某些抗藥性因子位于細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒上，質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌之間轉(zhuǎn)移，結(jié)果抗性菌日益增多，抗生素療效就越來(lái)越低。 為了對(duì)付細(xì)菌的抗藥性，科學(xué)家對(duì)原有的抗生素進(jìn)行了“整容手術(shù)”，細(xì)菌因再無(wú)法識(shí)別改頭換面的抗生素而被抑制或殺死。 現(xiàn)在已能使用克隆了?；富虻摹肮こ叹保ù竽c桿菌）高效率的生產(chǎn)半合成抗生素。臨床現(xiàn)在使用的貴重特效藥物先鋒霉素（頭孢菌素類(lèi)）、氨芐青霉素，就是這類(lèi)半合成抗生素類(lèi)藥物。國(guó)外已有幾十種這類(lèi)藥

12、物在實(shí)驗(yàn)室研制成功。,.,25,抗生素制備的一般流程圖,菌種 孢子制備 種子制備 發(fā)酵 發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾 提取及精制 成品檢驗(yàn),前體,發(fā)酵階段,提取階段,成品包裝,.,26,5 青霉素概述,.,27,青霉素的理化性質(zhì),青霉素本身為一元酸，可與鉀、鈉、鎂、鈣、鋁和銨等化合成鹽類(lèi)。 易溶于水，游離酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有機(jī)溶劑。 游離酸或鹽類(lèi)的水溶液均不穩(wěn)定，極易失去抗菌效力。 不耐熱，一般保存于冰箱中，但青霉素鹽的結(jié)晶純品，在干燥條件下可于室溫保存數(shù)年。 青霉素的抗菌效力與其分子中的-內(nèi)酰胺環(huán)有關(guān)。,.,28,抗菌作用和臨床應(yīng)用,青霉素主要抑制G+菌，但對(duì)某些G-菌，螺旋體及放線菌也

13、有強(qiáng)大的抗菌作用，青霉素的抗菌作用與抑制細(xì)胞壁的合成有關(guān)。 青霉素臨床上用于治療葡萄球菌傳染癥如腦膜炎、化膿炎、骨髓炎等，溶血性鏈球菌傳染癥如腹膜炎、產(chǎn)褥熱，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。,.,29,菌種：產(chǎn)黃青霉 生長(zhǎng)發(fā)育分七個(gè)階段： 期：菌絲生長(zhǎng)期，適宜做種子； 期：青霉素分泌期； 期：菌絲體自溶期。,5.1青霉素生產(chǎn)菌的特性,點(diǎn)青霉,.,30,青霉素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)過(guò)程,分生孢子發(fā)芽期 菌絲繁殖期 脂肪粒形成期 脂肪粒減少，小空孢 大空孢 自溶,菌絲生長(zhǎng)期,青霉素分泌期,菌絲自溶期,.,第1期：分生孢子萌發(fā)，具有小泡。 第2期：菌絲繁殖，嗜堿性，類(lèi)脂肪小顆粒。 第3期：脂肪包涵體，貯藏物，嗜

14、堿性很強(qiáng)。 第4期：空泡，嗜堿性減弱，開(kāi)始產(chǎn)生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大顆粒，脂肪包涵體 消失，青霉素產(chǎn)量最高。 第6期：個(gè)別細(xì)胞自溶，胞內(nèi)無(wú)顆粒，釋放氨， pH上升。 第7期：菌絲完全自溶，僅有空細(xì)胞壁。,發(fā)酵培養(yǎng)下的生長(zhǎng)過(guò)程及細(xì)胞學(xué)變化,.,鏡檢控制 規(guī)定時(shí)間取樣，顯微鏡觀察7 個(gè)時(shí)期的 態(tài)變化，控制發(fā)酵。 1 4 期為菌絲生長(zhǎng)期，3 期的菌體適宜 種子。 45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過(guò) 工程措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。 第6期到來(lái)之前結(jié)束發(fā)酵。,.,帶放補(bǔ)料,工,6.1青霉素生產(chǎn)流程,結(jié)晶器,種子罐 1和2,米孢子,預(yù)處理罐,過(guò)濾器,發(fā)酵罐,萃取器,蒸發(fā)器,工業(yè)鹽,提 煉,工

15、,藝,藝,發(fā) 冷凍干燥孢子 瓊脂斜面 酵 培養(yǎng)基制備,無(wú)菌空氣,冷至15,6.青霉素發(fā)酵工藝過(guò)程,.,(1)、生產(chǎn)孢子制備 斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固 體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，最適溫度25-26 ，培養(yǎng)6-8天，形 成單菌落。再傳斜面，培養(yǎng)7天，形成綠色斜面孢子。 米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基 上，生長(zhǎng)7天，25 注意：每批孢子必需進(jìn)行嚴(yán)格搖瓶試 驗(yàn)，測(cè)定效價(jià)及雜菌情況。,6.2 青霉素發(fā)酵工藝過(guò)程,.,(2)、種子罐培養(yǎng)工藝 一級(jí)種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。 培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫 劑等。 空氣流量1：3（體積比）；充分?jǐn)嚢?00-350

16、rpm； pH自然，溫度271, 40h 二級(jí)種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10 培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。 通氣量1:1-1.5；攪拌250-280rpm；pH自然，251。 10-14h 質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h,.,(3)、生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝 三級(jí)罐：生產(chǎn)罐；接種量20 培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨， 硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油. 參數(shù)條件： 通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min； 前60小時(shí):pH6.4-6.6，26； 60小時(shí)后: pH6.7, 24。,.,6.3 發(fā)酵培養(yǎng)與過(guò)程控制 操作方式：反

17、復(fù)分批式發(fā)酵 發(fā)酵罐： 100m3，裝料80m3. 帶放: 6-10次，帶放量10，間隔24h。 發(fā)酵周期：180-220h,發(fā)酵過(guò)程需連續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨以及前體物質(zhì)苯乙酸鹽，補(bǔ)糖率是最關(guān)鍵的控制指標(biāo)，不同時(shí)期分段控制。,.,過(guò)程控制補(bǔ)料分批操作控制基質(zhì)濃度 前40小時(shí)：培養(yǎng)基中的主要營(yíng)養(yǎng)物 40小時(shí)后：低速連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖、 氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。 半饑餓狀態(tài)：延長(zhǎng)合成期，提高產(chǎn)量。 碳源占成本12以上，采用糖化液流加,降低成本。 糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。,.,a.流加碳源控制 根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。 殘?zhí)?.3-0.6左右，pH

18、開(kāi)始升高時(shí)流加糖。 葡萄糖的波動(dòng)范圍較窄，濃度過(guò)低使抗生素合成 速度減慢或停止，過(guò)高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至 引起自溶。,(1)培養(yǎng)基,.,b.流加氮源控制 玉米漿: 最好，含有多種氨基酸 及其前體苯乙酸和衍生物。 補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源： 硫酸銨、氨水、尿素 氨基氮濃度：0.01-0.05%。,.,c.鹽離子控制 無(wú)機(jī)鹽：硫、磷、鎂、鉀等。 鐵對(duì)青霉素合成有毒，30-40 ug/ml以下。 罐壁涂環(huán)氧樹(shù)脂保護(hù)層。,.,d.添加青霉素側(cè)鏈前體 時(shí)期：合成階段 種類(lèi)：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、 苯乙酰甘氨酸 毒性：抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和青霉素合成。 策略：低濃度流加 濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.0

19、5-0.08% 控制：保持供應(yīng)速率略大于生物合成需要。,.,(2).溫度控制 適宜菌絲生長(zhǎng)溫度30，分泌青霉素25。 20青霉素破壞少，周期很長(zhǎng)。 變溫控制，不同階段不同溫度。 生長(zhǎng)階段:較高溫度，縮短生長(zhǎng)時(shí)間；生產(chǎn)階 段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。 前期控制26左右，后期降溫控制24,.,(3). pH控制 合成適宜pH6.46.6左右，避免超過(guò)7.0 直接加酸或堿：自動(dòng)控制 流加葡萄糖：恒速；變速，依賴(lài)pH變化快慢。 pH下降：補(bǔ)加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量 pH上升：補(bǔ)加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）,.,(4). 溶氧控制 30飽和度，產(chǎn)率急劇下降； 10，造成不可逆的損

20、害。 臨界溶氧濃度：30。 通氣比：1：0.81.5 。 適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧 調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長(zhǎng)和耗氧量不同。,.,(5).消沫 天然油脂：玉米油； 化學(xué)消沫劑：泡敵。 策略：少量多次。 注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。,.,7 青霉素的提煉工藝過(guò)程 青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活 水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定 易溶于有機(jī)溶劑，水中溶解度很小 青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性 防止降解，條件溫和、快速。,.,(1)、預(yù)處理,青霉素的存在部位：發(fā)酵液,濃度較低：1030Kg/m3,含有大量雜質(zhì)：菌體細(xì)胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁,多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等,目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液,的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過(guò)程。,預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白,.,(2)、過(guò)濾 鼓式真空過(guò)濾機(jī)過(guò)濾： 一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋 白質(zhì)含量0. 5-2.0%。 板框式過(guò)濾機(jī)過(guò)濾： 硫酸調(diào)節(jié)pH