Tale原理及操作.ppt

1、組會(huì)主要內(nèi)容,Tale技術(shù)的原理及應(yīng)用 介紹本課題組主要研究?jī)?nèi)容,無(wú)論研究什么生物現(xiàn)象， 都需要做一件事：改變基因 1） Loss function：降低基因或刪除基因 Give function: 提高基因的表達(dá),生物學(xué)家的夢(mèng)想：隨心所欲地操作基因,生物學(xué)家的夢(mèng)想：隨心所欲地操作基因,劃時(shí)代的基因靶向操作技術(shù)： TALE相關(guān)技術(shù)使靶向操作不再是夢(mèng) 我們不再大海撈針！,經(jīng)典基因操作：,Gene trap: 化學(xué)誘變； 轉(zhuǎn)座子-海量的篩選+good Luck 同源重組：一般物種幾率低, 10-6 ； ES cell 10-2 難！,突破性的發(fā)現(xiàn)： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，臨時(shí)

2、性,充滿夢(mèng)想?yún)s幻滅的ZFN： 難以完全找到匹配的3連子鋅指； Off-target 嚴(yán)重,美國(guó)加州大學(xué)Dave Segal教授說(shuō)： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target”,TALE的發(fā)現(xiàn)并迅速成為科技最前沿,完美基因靶向操作： 識(shí)別特異DNA序列的蛋白+操作DNA的酶,1989年，植物病原體黃單胞菌屬（Xanthomonas spp.）avrBs3 基因被克隆。 2009年TAL effector 氨基酸序列與核酸靶序列的密碼被破譯 2011年8月，Nature Biotechonlogy 同時(shí)發(fā)

3、表4篇TALEN基因敲除文章及一篇綜述,TALE： transcription activator like effector,TALE的密碼和原理,DNA,RNA,Protein,中心法則密碼的延伸：,TALE的結(jié)構(gòu),Dong Deng et al., Science 5 January 2012 ,121:5670,TALE的主要兩個(gè)應(yīng)用,TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases） 識(shí)別任意特定核酸靶序列的重組核酸酶 2. TALEA （transcription activator-like (TAL) eff

4、ector activator） 或TALE-TF 激活體內(nèi)任意目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄激活因子,TALEN-神奇的基因剪刀,TALEN兩部分組成：識(shí)別特異DNA序列的TALE和內(nèi)切酶FOKI,有了TALEN, 想在哪里剪斷DNA就在哪里剪。,用于基因敲除的TALEN,細(xì)胞內(nèi)基因組DNA被TALEN剪切后，誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞可以通過(guò)NHEJ（Non-homologous End Joining）修復(fù)DNA，在此修過(guò)程中或多或少地刪除或插入了一定數(shù)目的堿基，造成移碼，形成目標(biāo)基因敲除突變體。 TALEN敲除基因的效率大約為20%，從1%-30%。 最好的TALEN達(dá)50%,TALEN-神奇的基因

5、剪刀,用于同源重組的TALEN：提高同源重組10-100 倍,TALEN剪切DNA產(chǎn)生DSB后，若能提供同源修復(fù)模板，細(xì)胞可通過(guò)同源重組方式修復(fù)DNA，因此可以對(duì)內(nèi)源DNA做更精細(xì)的操作，如點(diǎn)突變（磷酸化位點(diǎn)）、保守區(qū)域替換、 N端或C端加標(biāo)記（GFP、HA、Flag。）等等。,TALEN-神奇的基因剪刀,TALEN的應(yīng)用： 模式生物的基因敲除,In vitro Transcription,Microinjection,基于ES cel和同源重組的基因敲除,TALEN的基因敲除,2-6月,3月,3月,5-10天,3月,TALEN的應(yīng)用： 模式生物的基因敲除-Rat 基因敲除,TALEN 靶點(diǎn)位

6、置,TALEN 敲除大鼠的幾率,Nature biotechnology V29:695,TALEN的應(yīng)用：人類IPS干細(xì)胞的基因修飾,TALEN極大地提高了同源重組的效率,Nature biotechnology V29:731,TALEN的應(yīng)用： HIV的治療,流水細(xì)胞分離檢測(cè)敲除效率,將識(shí)別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄激活因子VP64 融合，表達(dá)的融合蛋白結(jié)合啟動(dòng)子附近的特異DNA序列， 并通過(guò)VP64激活區(qū)域與Pol II 結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄，提高了內(nèi)源目標(biāo)基因的表達(dá)。,TALEA-人工轉(zhuǎn)錄因子,TALEA-人工轉(zhuǎn)錄因子,TALE應(yīng)用展望-TALEX,將識(shí)別特DNA序列的TALE與不同的蛋白酶融合，實(shí)現(xiàn)不同的靶向基因操作的應(yīng)用： 抑制基因表達(dá) - TALER 啟動(dòng)子附近的甲基化 - TALEM 特定序列的重組酶 -TALER 光控表達(dá)的TALEN或TALEA-TALEL 。,TALE常見(jiàn)組裝技術(shù),時(shí)間花費(fèi)長(zhǎng) 6 步 質(zhì)粒的構(gòu)建： 6X3-6天=18-36天。不包括每步的測(cè)序等待時(shí)間。 工作量巨大 16個(gè)質(zhì)粒。 活性并不保證,唯尚立德的TALEN活性檢測(cè)方法,酶切法 Luciferase SSA 法,TGTTGGCTTTGATGCTGTTACTGGAgaattcACTGTAAGTTAACCTAGTTCGGGCC,E