液相色譜儀日常維護及常見故障解決.ppt

1、1 流動相 2 脫氣機（在線） 3 泵（單元、二元、四元） 4 進樣器（手動、自動） 5色譜柱 6 檢測器(VWD/DAD/FLD/RID),一、液相色譜儀日常維護及注意事項,所用溶劑應為HPLC級，水應為二次超純水； 所用溶劑應經過過濾。過濾水應使用水相濾膜，過濾有機相應使用有機相濾膜，不能混用，也不要用錯。每一張濾膜只能用一次，不能重復使用。 如果沒有在線脫氣機，所用溶劑應經過超聲脫氣。 水易滋生藻類，避免直接照射，過濾后的水最好使用不要超過兩天。 如果條件允許可向溶劑中加入0.001-0.0001M的疊氮化鈉。 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑。 避免使用強酸、強堿或有機氯等腐蝕性

2、溶劑。 在溶劑瓶中的溶劑過濾頭可能會堵塞，必要時小心拿下用強酸（35%硝酸）浸泡1小時，用水沖洗，但不要使用超聲處理。,1 流動相,溶劑信息,避免使用下列對不銹鋼有腐蝕性的溶劑： 鹵化物堿金屬溶液和相應的酸溶液。 高濃度的無機酸例如：硝酸和硫酸。 能夠形成鹵素自由基或酸的氯化試劑及其混合物。 含有過氧化物的色譜級醚必須用氧化鋁干燥劑。 在有機溶劑中的有機酸溶液。 含有強絡合劑的溶液。 四氯化碳和異丙醇或THF混合液。,溶劑截止波長,所以在使用紫外檢測器時，所用波長應至少比所用溶劑的截止波長大20nm以上。,在使用紫外檢測器時，所用波長與所用溶劑的截止波長接近（或低于截止波長）時，容易產生噪音干

3、擾，從而影響檢測結果。,生色團和最大吸收波長,溶劑、PH、溫度等都會影響生色團的最大吸收峰的強度和位置。,溶劑過濾,選擇合適的濾膜,聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。 醋酸纖維濾膜：適用于水基溶劑，不適用于有機溶劑，推薦用于蛋白質和其相關的樣品。 尼龍66濾膜：適用于絕大多數有機溶劑和水溶液，可用于強酸、70%乙醇、二氯甲烷、不適用于DMF二甲基甲酰胺。 再生纖維素濾膜：具有蛋白質吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑。 注意：1，每張濾膜只能用一次。 2，水相和有機相不要搞混。,柱塞清洗附件Seal Wash,HPLC使用緩沖溶液Buffer時，由于緩沖鹽溶液存在高壓鹽

4、析現象，析出的細小鹽粒會損傷藍寶石柱塞桿和密封墊，從而造成漏液等故障現象，因而建議選配柱塞清洗附件Seal Wash。 緩沖鹽濃度大于0.01mol時，強烈建議選配在線的柱塞清洗附件Seal Wash。 清洗液配置：90%水+10%異丙醇溶液，流速為2-3滴/min。該混合液可抑制菌類生長和降低水的表面張力。清洗液虹吸流出，不能干涸。,目的,脫氣方法： 氦氣脫氣 回流加熱脫氣 真空脫氣 超聲脫氣,排除溶解在流動相中的氧氣和氮氣,2 脫氣機,在線真空脫氣機,為保證脫氣機的良好使用性能，在下述情況下需要用注射器抽洗脫氣機管路，每個通道使用不低于30ml的異丙醇。 1，新的脫氣機或新的管路； 2，更

5、換了溶劑，尤其是緩沖鹽與有機相之間、兩個不相容流動相之間的互換時； 3，輸液泵關閉了一段時間，或使用揮發(fā)性溶劑混合物。 4，完成上述操作后，打開清洗閥，用大流量沖洗，5ml/min。,阻尼器/壓力傳感器,泵驅動,溶劑瓶,梯度比例閥,主動輸入閥AV,出口球閥BOV,清洗閥Purge Valve,柱塞桿Piston,3 泵,二元泵工作原理,Damper,Purge valve,Mixer,A,B,Inlet valve,Outlet valve,泵的注意事項,1，溶劑的過濾、脫氣； 2，避免使用腐蝕性溶劑； 3，在滿足分析的前提下，盡可能使用較低的流速較低的系統(tǒng)壓力。 4，更換過濾白頭； 5，考慮

6、溶劑的相容性； 6，盡可能使用新鮮的水； 7，使用0.01M以上濃度的緩沖溶液要選配柱塞清洗組件，清洗液不能干涸。 8，使用正相溶劑比如環(huán)己烷時，建議使用聚乙烯密封墊，在0200Bar下使用聚乙烯密封墊比標準密封墊更耐磨損。,四元泵： 四元泵多通道比例閥MCGV使用時注意，緩沖溶液要放在下面通道，以避免鹽顆粒析出。 二元泵： 設置壓縮因子補償，以達到最佳比例效果。,4 進樣器,From Pump,To Waste,手動進樣器,樣品要干凈、經過過濾。 合適的進樣體積，比如定量環(huán)為20ul，進樣體積應為010ul，或者20ul，進樣20ul時注射樣品量應至少60ul以上。 定期清洗進樣閥，清洗過程

7、如下： 1，將進樣閥旋至Inject位置； 2，用帶有專用頭的注射器用純水約2030ml沖洗進樣閥； 3，將進樣閥旋至Load位置。 參考左圖。,手動進樣器,自動進樣器,準備位置,調用樣品瓶 吸樣品,進樣和運行位置,標準進樣過程 .,自動進樣器,樣品要干凈、經過過濾。 洗針：把樣品殘留降低到最小限度，可降低進樣的記憶效應，洗針瓶最好不要加瓶墊。 多次吸液用于進樣量大于100ul,色譜柱保護,過濾所有的溶劑和樣品 使用保護柱 儀器在使用完畢，要沖洗整個系統(tǒng)，移走系統(tǒng)中的緩沖液。 柱子在不使用時，兩端密封保存 在適當的溶劑中保存柱子 注意色譜柱的pH值使用范圍 不要高壓沖洗柱子 不要高溫下過長時間

8、使用硅膠鍵合相,色譜柱的再生,進行色譜柱再生時，應使用一個廉價的泵，我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。 色譜柱尺寸 柱體積 所用溶劑的體積 125-4 1.6ml 30ml 250-4 3.2ml 60ml 250-10 -20ml 400ml 請根據下表選擇您的再生方法： 極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生： 正庚烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水* 非極性固定相（如反相色譜填料RP18，RP8，CN等）的再生： 水乙腈氯仿（或異丙醇）乙腈水 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱 注意： 在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應

9、該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。 *如果簡單的有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。,6 檢測器,VWD的光源氘燈有一定的半衰期，一般為1000小時左右，所以在沒有樣品分析任務時要關閉氘燈，以延長氘燈的使用壽命。 流動池污染后，會造成靈敏度下降、噪聲加大，應避免臟的樣品進入流動池。定期使用異丙醇沖洗系統(tǒng)對保持流動池性能有一定好處。 更換氘燈。,能引起HPLC發(fā)生問題的潛在因素: 工作環(huán)境電源及地線 流動相泵 進樣器保護柱 在線過濾器連接管路 色譜柱檢測器 數據處理裝置操作,二、液相色譜儀故障分析,邏輯判斷及處理 問題

10、 化學品 環(huán)境 機器 *色譜柱/保護柱*電源 *泵 *溶液*地線 *進樣器 *樣品*溫度 *檢測器 *濕度 *數據處理單元 *清潔程度,液相色譜儀器出現故障可以從多方面入手,1.從部件的運轉情況推測，如壓力、流速的變化 2.從色譜圖的異常情況推測，如出峰時間、峰形 3.從數據結果中分析,流動相內含有空氣 - 脫氣處理 檢測池內有氣泡 - 沖洗檢測池或在檢測池出口接一段內徑0.009“的 管子(此法只適用于耐壓檢測器 !) 色譜柱內有未洗脫盡的組份 - 洗脫色譜柱. 系統(tǒng)有漏液之處 - 檢漏并處理 電噪聲 - 去除噪聲源, 信號線屏蔽, 檢查系統(tǒng)接地狀況 檢測器光源燈能量低 - 更換光源燈 檢測

11、池污染 - 沖洗檢測池,典型故障分析及實例基線噪聲,基線周期性噪聲 絕大多數情況下是來源于泵的問題 泵頭內有氣泡 - 流動相脫氣 ,泵頭排氣(注意正確的排氣方法) 泵進出口閥有問題 - 更換閥組件 柱塞桿有問題 - 更換柱塞桿及其密封圈 溶劑混合不良 - 加裝混合器 電噪聲 - 去除噪聲源,非周期性噪聲 氣泡 - 流動相脫氣 檢測池內有氣泡 - 流動相脫氣, 檢測池后加適當反壓 系統(tǒng)有漏液之處 - 檢漏并處理 溶劑混合不良 - 加裝混合器 電噪聲 - 去除噪聲源,基線漂移 梯度系統(tǒng) - 溶劑A于溶劑B的ABS值相差大 - 試用另種溶劑或使用基線扣除法 色譜柱有其他組份被洗脫出 - 沖洗, 直至

12、基線穩(wěn)定 溶劑發(fā)生變化 (如溶入氣體或溶劑揮發(fā)) - 氦氣或脫氣機脫氣, 溶劑瓶避光,密封(但要 注意防止溶劑瓶內產生負壓) 系統(tǒng)有漏液之處 - 檢漏并處理 環(huán)境溫度影響 (尤其對示差,電導,電化學檢測) - 室溫,柱溫,檢測池溫度控制 反壓變化 - 溶劑和樣品過濾. 注意黏度過大的樣品,基線周期性波動 溫度影響 - 環(huán)境溫度及檢測池溫度控制. 注意空調機的 影響 溶劑混合不良 - 加裝混合器 流動相脫氣不良 - 流動相脫氣 供電電源的影響 泵不良 - 檢修處理,基線有無規(guī)律的尖峰 氣泡 - 溶劑脫氣 電路接觸不良 - 保證清潔, 接線牢固, 接點無氧 化 光源燈不良- 檢查處理 電噪聲 -

13、去除噪聲源,無樣品峰 未進樣 泵未工作 漏液 流動相或樣品的問題 柱子或保護柱的問題 數據采集裝置的問題或其與檢測器連線的問題 最簡單快捷的檢查 - 泵是否工作, 系統(tǒng)是否漏液, 進一針丙酮溶液檢查檢測器讀數及數據單元是否有響應,負峰 組份的ABS值小于溶劑的ABS值 氣泡通過了檢測池 對RI檢測器不一定是有了問題，很可能是正常的 所有峰都是負峰 - 可能是檢測器輸出與數據單元連線 極性接反,峰形不好 - 如峰拖尾, 峰分叉, 出肩膀 在線過濾器(IN LINE FILTER)污染 (通常會伴隨有系統(tǒng)壓力升高之現象) 色譜柱污染 系統(tǒng)有不正常的死體積- 檢查管路連接是否正確- 內徑, 接頭 保

14、護柱(GUARD COLUMN)污染 溶劑不好或使用不對 樣品不好 色譜柱壞了- * PH 8 會破壞柱子內的填料 * 流速變化率太大- 操作上應注意,兩個要點- 峰保留時間(RT)重現性, 峰面積重現性 RT重現性不好 - 無規(guī)律變化 : *流量不穩(wěn) - 氣泡, 漏液, 泵 *溫度影響 有規(guī)律的變化, 且逐漸趨于穩(wěn)定 : 系統(tǒng)未充分平衡 RT 重現性好, 但峰面積重現性不好 - *進樣量-選用定量管進樣時,進樣 體積應大于3倍定量管容積; *樣品, 氣泡; *樣品在流動相各組份中不能充分 溶解(通常伴隨有柱壓逐漸升高 且經反沖后,柱壓會恢復正常之現 象); *基線噪聲的影響; *積分處理的影響;,系統(tǒng)性能：重復性差,常見故障分析列表：一.從壓力變化判斷,1.壓力無,2.壓力高,3.壓力低,4.壓力不穩(wěn),1.峰前沿,二、從色譜圖的異常情況推測,2.峰拖尾,3.峰變寬,4.峰分叉,5.無峰,6.負峰,7.鬼峰,8.保留時間變化,9.保留時間不斷變化,10.基線漂移,11.無規(guī)則基線噪音,12.規(guī)則基線噪音,三、從數據結果中分析,1.定量結果,2.定性結果,想一想,看一看: 1. HPLC系統(tǒng)中各機器是否開機正常 2. 溶劑瓶內溶劑是否新鮮且脫氣 3. 泵是否已初始化且工作正常