第二章組織培養(yǎng)基本技術(shù).ppt

1、第二章植物組織培養(yǎng)基本技術(shù)、第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和基本技術(shù)第二節(jié)組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件和營養(yǎng)成分第三節(jié)培養(yǎng)基的制備和滅菌第四節(jié)外植體的選擇和滅菌第五節(jié)外植體的接種和培養(yǎng)第六節(jié)外植體的褐變及其預(yù)防措施第七節(jié)玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施第八節(jié)試管苗的馴化和移植、第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和基本技術(shù)、一、 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)成二、儀器設(shè)備三、培養(yǎng)器和實(shí)驗(yàn)用具四、清洗技術(shù)五、滅菌技術(shù)六、無菌操作、組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求是隔離操作方便滅菌容易觀察，一、實(shí)驗(yàn)室構(gòu)成、基本實(shí)驗(yàn)室、輔助實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)室構(gòu)成、準(zhǔn)備室緩沖細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫室生化分析實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)臺、架子、培養(yǎng)架4.0m、準(zhǔn)備室、緩沖室、無菌室、培養(yǎng)室、組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室、緩

2、沖室、培養(yǎng)室、無菌室(1)、無菌室(2)、二、儀器設(shè)備、1、基本儀器設(shè)備1366911、冰箱、酸訂、電爐、天平， 純水器、培養(yǎng)基分注器、攪拌器、2、滅菌設(shè)備蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒箱、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽滅菌鍋、干熱消毒槽、無菌瓶的過濾裝置、噴霧消毒器、(參考圖)、(參考圖)、3、無菌操作設(shè)備、潔凈臺、無菌接種箱、4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、搖床、培養(yǎng)架、hzc 1.玻璃器、3、培養(yǎng)器及實(shí)驗(yàn)用具、培養(yǎng)皿、三角瓶、培養(yǎng)瓶、2、金屬材質(zhì)用具、鑷子清洗技術(shù)，1，玻璃器皿清洗，新使用過的塑料容器，2%NaOH浸漬12h，清水清洗，2%5%鹽酸浸漬30min，清水清洗，蒸餾水清洗，干預(yù)，3，金屬

3、用品清洗，熱洗滌劑水清洗，清洗(1) 培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法壓力9.810410.8104Pa溫度121滅菌2030min (2)玻璃容器滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌干熱消毒滅菌，飽和蒸汽壓力和相應(yīng)的溫度，(3)塑料容器滅菌：高壓蒸汽消毒滅菌多，然后放在酒精火焰上燒灼接種室滅菌、空氣消毒滅菌、接種室、潔凈臺、紫外線燈照射、70u%的酒精清洗、培養(yǎng)材料的接種、紫外線燈照射、(6) 10%的漂白水、飽和漂白劑浸漬30分鐘左右、預(yù)備、常用消毒劑消毒滅菌比較表、六、 無菌操作，實(shí)驗(yàn)者消毒，實(shí)驗(yàn)室，無菌臺滅菌，實(shí)驗(yàn)2 .打開潔凈桌和無菌操作室的紫外燈，照射40分鐘左右后關(guān)閉。 3 .打開過濾室的風(fēng)扇，

4、將無菌風(fēng)吹到桌面和周圍的桌壁上。 用70u%的酒精擦拭桌子和雙手。用含有5，70u %酒精的紗布擦拭裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)器，放入桌子。 6 .解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡95%酒精，在火焰上消毒，放置在器械架上。 7 .在酒精燈火焰附近切斷備用的接種材料。 8 .打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口來燒瓶口的各部分。 9、取下接種器具，在火焰上消毒。 將培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶中，關(guān)閉瓶口。 11 .接種結(jié)束后，清掃并關(guān)閉清潔臺。 注意：操作期間必須經(jīng)常用70u%的酒精擦拭桌子和雙手的接種器械浸泡在95%的酒精中，在火焰上消毒。 第二節(jié)植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件和營養(yǎng)成分，一、環(huán)境條件、自然條件一樣，組織培

5、養(yǎng)中外植體的生長需要如何控制溫度、光照、濕度等各種物理?xiàng)l件，不同氣體、培養(yǎng)基組成、pH值和滲透壓等各種化學(xué)條件，以及外植體的部位、大小、細(xì)胞密度等溫濕度氣體滲透壓pH值，一般最佳溫度在252之間，環(huán)境條件，最常用的是光照16h、黑暗8h，一般培養(yǎng)器內(nèi)的相對濕度達(dá)到100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度為70%，氧是愈傷組織生長所必需的。 二、營養(yǎng)成分、植物體內(nèi)至少含有數(shù)十種化學(xué)元素，其中大部分在植物體內(nèi)起一定的生理作用： a、構(gòu)成各種化合物、參與生物體建設(shè)、構(gòu)成結(jié)構(gòu)物質(zhì)的b、構(gòu)成特殊生理活性物質(zhì)、參與活躍新陳代謝的c、元素彼此協(xié)調(diào)、離子濃度平衡， 在維持膠體穩(wěn)定、電荷平衡點(diǎn)等化學(xué)方面的作用的d .發(fā)

6、育方面，特定的元素會影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建造。Arnon和Stout(1939 )提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個標(biāo)準(zhǔn)：亞倫和斯多德，a，由于缺乏該元素，植物生長發(fā)生障礙，無法完成其生活史的b .如果缺乏該元素，則表現(xiàn)為特異性病癥， 而且這種缺素癥可以通過補(bǔ)充這種元素進(jìn)行預(yù)防和恢復(fù)c .這種元素在植物營養(yǎng)生理上顯示出直接效應(yīng)，而不是改善土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的間接效應(yīng)。 國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物需要的營養(yǎng)素為16(17 )種： c、h、o、n、p、k、Ca、Mg、s、Fe、b、Mn、Cu、Zn、Mo根據(jù)植物體內(nèi)的含量，可將這些元素分為大量的營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上s等9

7、種微量營養(yǎng)素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下的是0.1mg/kg Fe、b、Mn、Cu、Zn、Mn的p是磷脂的主要成分。 培養(yǎng)基常用KH2po 4、nah2po 4等。 k與碳水化合物的合成、轉(zhuǎn)移、氮代謝等有密切關(guān)系。 Mg、s、Ca是葉綠素的組成成分，是激酶的活化劑，對核蛋白質(zhì)體結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定作用的s是含有s氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。 Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，在細(xì)胞分裂、穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中起著顯著作用，而Ca及降鈣素在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。2、微量元素是微量元素中鐵的使用最大的：部分氧化酶的組成成分葉綠素形成的必要條件是使用乙二胺四乙酸鐵(EDTA-Fe )螯合物防止鐵沉淀，與硼和蛋白質(zhì)的合成、糖

8、類的運(yùn)輸有密切關(guān)系的銅是部分氧化酶的成分， 錳能促進(jìn)離體根的生長，促進(jìn)植物的光合作用，呼吸代謝鉬參與氮的缺鐵癥狀：葉面變成綠色網(wǎng)狀失去了綠色。 隨著病情的發(fā)展，葉子失綠程度加重，整片葉子變白，葉緣枯萎，引起落葉。 缺鐵嚴(yán)重時(shí)，新梢頂端枯死。 桃樹，缺銅癥狀：新梢尖端葉尖失綠變黃，葉上出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)擴(kuò)大成深褐色，引起落葉。 枝梢生長不良，其下部芽開始生長，形成群生的小枝。 菊花、缺錳癥狀：雖然葉脈間有失綠退色，但葉脈仍保持綠色，也有脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀從幼葉開始。 菜豆，梨缺錳癥，缺鉬癥狀：葉小，葉脈間喪失綠色，有壞死斑，葉邊燒焦，內(nèi)側(cè)卷曲。 十字花科植物缺鉬時(shí)葉子變形，老葉變厚枯焦。 白菜，

9、缺硼癥狀：受精不良，種子減少，“花不結(jié)果”，“花蕾無花”； 根尖、莖尖的生長點(diǎn)停止生長，多會引起形成群生狀的各種腐病。 馬鈴薯、缺鋅癥狀：小葉病、葉變小，兩者之間變短。 在葉脈間失去綠色或變白。 植物缺素癥、缺氮：首先老葉呈現(xiàn)均勻缺綠現(xiàn)象缺磷：老葉呈藍(lán)色略帶紫色，葉緣呈紫紅色，葉尖枯死缺鉀：首先老葉斑缺綠癥狀葉緣枯萎，卷曲收縮，莖節(jié)間縮短。 鈣不足：新葉的葉子變小，枯死，即干燥燒心的硫不足：首先作為新葉的葉子的綠不足或紫發(fā)現(xiàn)的缺錳：新葉脈間的失綠； 鐵缺乏：葉黃，葉脈綠缺硼：頂和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，叢枝鋅缺乏：老葉脈之間缺乏綠色，出現(xiàn)白色壞死斑的銅缺乏：新葉從葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴(yán)重

10、的整葉枯萎過早脫落的鉬缺乏： 3 .碳源碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，糖類物質(zhì)最為重要。 糖類的特點(diǎn)：熱量易利于吸收和利用的濃度一般以2%-5%提供能量，調(diào)節(jié)滲透壓，4、維生素以各種輔酶的形式存在，參與多種代謝活動，對生長分化等有良好的促進(jìn)作用， 脂溶性維生素和水溶性維生素中常用的維生素是VB1和VB6。肌醇環(huán)己醇細(xì)胞壁的構(gòu)筑材料是碳水化合物， 參與磷脂代謝及離子平衡等生理活動促進(jìn)活性物質(zhì)的作用6 .氨基酸蛋白質(zhì)的構(gòu)成成分有機(jī)氮源在細(xì)胞可直接吸收利用的培養(yǎng)基中常用的有甘氨酸7，有天然復(fù)合體促進(jìn)愈傷組織和器官生長的化學(xué)成分不明，復(fù)雜的天然營養(yǎng)混合物，如水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物9

11、 .抑制活性炭吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)外植體的褐變，抑制玻璃苗的產(chǎn)生，促進(jìn)培養(yǎng)物的生長和分化，促進(jìn)生根10 .防止抗生素外植體內(nèi)生菌造成的污染活性炭11 .生長素類促進(jìn)細(xì)胞的伸長和分裂，促進(jìn)生根，抑制臟器的脫落，控制性別， 延長休眠，尖端優(yōu)勢，單性結(jié)實(shí)誘導(dǎo)愈傷組織溶解于95%醇或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更為常用的生長素： IAA (吲哚辛) NAA 12 .細(xì)胞因子類促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成，延緩組織老化用于控制離體造花的0.5-1.0mol/L鹽酸或稀薄NaOH常用細(xì)胞因子： KT (激動劑) BA(6-總統(tǒng)府基腺嘌呤)2ip 13 .赤霉素

12、類和脫落酸a、赤霉素類的組織培養(yǎng)不太使用的加速細(xì)胞的伸長生長促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基形態(tài)的差異：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程的差異：初代培養(yǎng)基、傳代培養(yǎng)基的作用的差異：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、定著培養(yǎng)基的營養(yǎng)水平的差異：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、一、培養(yǎng)基的種類、第3節(jié)培養(yǎng)基的制備、滅菌和保存，1，MS培養(yǎng)基的無機(jī)鹽濃度特別是硝酸鹽包含一定量的銨鹽無需進(jìn)一步添加有機(jī)附件，二是一些常見培養(yǎng)基的特點(diǎn)，二是White培養(yǎng)基在1943年White為培養(yǎng)番茄根尖而修訂的1963年改良，提高M(jìn)gSO4的濃度，降低硼無機(jī)鹽濃度，對廣泛根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)有良好效果附表：白色培養(yǎng)基、3、B5培養(yǎng)基是1968年Gambor

13、g等人為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而修訂的，含有低銨鹽的高硝酸鹽和鹽酸硫胺素、B5培養(yǎng)基的組成和配方，4、N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等人為培養(yǎng)水稻等谷類作物的花藥而修訂的KNO3和藥品的準(zhǔn)備3、培養(yǎng)基的配方、母液的擴(kuò)大率及應(yīng)該調(diào)制的培養(yǎng)基體積來修正所需的各種母液及其他附件的量；3、包括培養(yǎng)基的調(diào)制，具體操作如下：2.根據(jù)修正所需的量依次加入大量的元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長調(diào)整物質(zhì)母液及其他特殊的附件，均勻6 .封口(擰緊瓶蓋)。 由于組織培養(yǎng)必須在無菌環(huán)境下進(jìn)行，因此培養(yǎng)基的滅菌操作非常重要。 培養(yǎng)基分注封口后立即進(jìn)行滅菌，至少在24h以內(nèi)完成滅菌程序。 一般采用高壓蒸汽滅菌。 四、培養(yǎng)基滅菌、滅菌鍋很多。 實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用便攜式高壓蒸汽滅菌鍋。 使用時(shí)，請注意： 1、鍋中注入足夠量的水，不要引起空燒和干燒2 .放鍋時(shí)不要過度傾斜，內(nèi)部有一定的空間，有利于蒸汽流動3 .增壓前的高壓鍋內(nèi)的空氣必須清潔排出。 如果不這樣做，容易對滅菌效果產(chǎn)生影響，4、在滅菌中，盡量保持壓力恒定，嚴(yán)格遵守滅菌時(shí)間5 .排