淺析細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法及常見問題.ppt

1、淺析細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法及常見問題,內(nèi) 容,細(xì)菌內(nèi)毒素簡(jiǎn)介 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法 常見問題及解決方案,一、細(xì) 菌 內(nèi) 毒 素 簡(jiǎn) 介,主要內(nèi)容 來源 特性 與熱源的關(guān)系 在藥檢中應(yīng)用,主要來源 主要來自于革蘭氏陰性桿菌，當(dāng)細(xì)菌死亡或自溶后便會(huì)釋放出內(nèi)毒素，其化學(xué)成分主要是脂多糖，這是一種大分子物質(zhì)，分子量約為106，其粒徑約在1 5納米 。 細(xì)菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中。如自來水中含內(nèi)毒素的量為1至100EU/ml。,主要特性（實(shí)驗(yàn)器材處理方法） 1.耐熱性 一般在100加熱1小時(shí)無影響，120加熱4小時(shí)能破壞98，180200干熱2小時(shí)或250干熱半小時(shí)才能完全破壞。 故：注射劑的一般滅菌條件是

2、不能破壞內(nèi)毒素的。 2.不耐酸堿性 內(nèi)毒素可被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和氧化劑破壞。 故：玻璃器皿用鉻酸洗液浸泡,主要特性（實(shí)驗(yàn)器材處理方法） 3.水溶性與不揮發(fā)性 熱原能溶于水，本身不具揮發(fā)性，但能隨水蒸氣霧滴夾帶入蒸餾水中，造成污染。 故：不可用濕熱滅菌法處理實(shí)驗(yàn)器具,主要特性（去除內(nèi)毒素方法） 4.濾過性 原體積很小，約在15 nm之間，故能通過除菌濾器而進(jìn)入濾液中，但不能通過石棉濾板，也不能通過半透膜。 5.吸附性 能被活性炭吸附劑吸附。內(nèi)毒素在溶液中帶有一定的電荷，因而可被某些離子交換介質(zhì)吸附。,熱原=內(nèi)毒素 ？ 熱原指微生物產(chǎn)生的某些多糖蛋白復(fù)合物等使人體發(fā)熱的物質(zhì)，不僅僅是細(xì)菌內(nèi)毒素。 但在藥

3、檢的范疇，細(xì)菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。,熱原檢查方法簡(jiǎn)介 中國藥典熱原檢查方法是采用家兔升溫法進(jìn)行檢查。 將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。,熱原檢查法,與熱源對(duì)比內(nèi)毒素檢查法優(yōu)勢(shì) 方便、快捷、經(jīng)濟(jì)； 重現(xiàn)性好、靈敏度高； 避免抗原的產(chǎn)生，克服生物測(cè)定的誤差； 近年來已經(jīng)普遍采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，逐漸替代了熱源法,在藥檢中的應(yīng)用 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查作為控制藥品質(zhì)量的一種方法，已經(jīng)廣泛的被世界各國藥典收載。 成品檢查藥品安全性檢查之一 半成品（生產(chǎn)過程）檢查事前質(zhì)控手段

4、，避免造成藥品成批報(bào)廢,二、細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法,中國藥典批準(zhǔn)使用方法： 供試品檢測(cè)時(shí)，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗(yàn)。但當(dāng)測(cè)定結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。 本節(jié)將著重介紹凝膠法的操作與有關(guān)原理。,測(cè)定 方法,凝膠法,光度測(cè)定法,濁度法,顯色基質(zhì)法,鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)機(jī)理,內(nèi)毒素,C因子,活化的C因子,凝膠,B因子,凝固酶原,凝固酶,活化的B因子,凝固蛋白原,鱟凝血系統(tǒng)酶聯(lián)反應(yīng),名詞解釋1鱟及鱟試劑,鱟：一種古老的棲身于沿海的海洋生物，節(jié)肢動(dòng)物 門，在我國主要分布于浙江、福建及兩廣的沿海一帶。 鱟試劑：利用鱟血液中的變性細(xì)胞，經(jīng)裂解液和機(jī)械方式促使細(xì)胞破裂而提取到的一種細(xì)胞溶解

5、物，能與極微量的細(xì)菌內(nèi)毒素形成特異凝膠反應(yīng)，反應(yīng)的速度和凝膠的堅(jiān)固程度與內(nèi)毒素濃度有關(guān)，是體外檢測(cè)內(nèi)毒素的敏感試劑。,名詞解釋2國家標(biāo)準(zhǔn)品及工作標(biāo)準(zhǔn)品,國家標(biāo)準(zhǔn)品： （單位：EU/ml） 自大腸埃希菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)； 工作標(biāo)準(zhǔn)品： 經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋用于試驗(yàn)中鱟試劑靈敏度符復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對(duì)照；,名詞解釋3細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水,凝膠法： 內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水； 故：滅菌注射用水細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 光度法： 內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.005EU/ml；,細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)之凝膠法,實(shí)驗(yàn)程序 1、試驗(yàn)準(zhǔn)備：試劑、

6、儀器及用具 2、選擇鱟試劑靈敏度，計(jì)算樣品稀釋度 3、鱟試劑靈敏度復(fù)核 4、供試品干擾試驗(yàn)（新藥或新方法） 5、供試品細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè),實(shí)驗(yàn)材料及用具 1、儀器,2、器具,試劑 1、鱟試劑：具有國家頒發(fā)的批準(zhǔn)文號(hào) 2、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品 3、內(nèi)毒素檢查用水 4、75乙醇 常用英文縮寫 BET：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 BET水：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水 MVD：供試品最大有效稀釋倍數(shù) NC：陰性對(duì)照 MVC：供試品最低有效濃度 PC：陽性對(duì)照 ：鱟試劑靈敏度 L：供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值,靈敏度復(fù)核試驗(yàn)：每批鱟試劑用于檢測(cè)前都必須進(jìn)行靈敏度復(fù)核。目的是為了對(duì)試劑、檢測(cè)者的操作、環(huán)境條件、水平條件進(jìn)行驗(yàn)證。以證實(shí)

7、操作正常無誤，準(zhǔn)確可靠和結(jié)果可信。 試驗(yàn)舉例：內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品為90EU/支； 待測(cè)鱟試劑靈敏度0.25EU/ml。 1、制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸出劃痕，用75酒精擦拭后啟開，加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩渦振蕩器上混勻15min后進(jìn)行稀釋，步驟如下(箭頭下方為加入BET水量)：,90EU/ml,10EU/ml,1EU/ml,0.5EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml,0.0625EU/ml,0.2ml,1.6ml,0.2ml,1.8ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,0.2ml,0.2

8、ml,1ml,1ml,1ml,1ml,水,水,溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品,水,水,水,水,90 EU/ml,10 EU/ml,1 EU/ml,0.5 EU/ml,0.25 EU/ml,0.125 EU/ml,0.0625 EU/ml,（2 ）,（ ）,（0.5 ）,（0.25 ）,2、溶解鱟試劑：若鱟試劑為0.1ml裝量，則取18支，每支加入0.1mlBET水溶解；若鱟試劑裝量大于0.1ml，則取若干支，按標(biāo)示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分裝于標(biāo)準(zhǔn)玻璃試管（10mm75mm），將試管按如下形狀排列。 3、加樣：每列每支加入相應(yīng)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0.1ml，第五列加入BET水0.1ml。,1

9、2,2 ,3 0.5,4 0.25,BET水,2,2,2,2,0.5,0.5,0.5,0.5,0.25,0.25,0.25,0.25,反應(yīng)及結(jié)果判斷：加樣結(jié)束后用封口膜封口，輕振動(dòng)混勻，置37 水浴中保溫602min，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180，凝膠不變形為“”，凝膠不能保持完整為“”。 當(dāng)2.0四支管都為陽性，0.25四支管都為陰性時(shí)，試驗(yàn)成立，按下面底公式計(jì)算復(fù)核的靈敏度c ： clg-1(X/4) （X:反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值。） 當(dāng)0. 5c 2.0時(shí)，鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，檢測(cè)時(shí)仍以標(biāo)示靈敏度為準(zhǔn)。,左側(cè)管旋轉(zhuǎn)180凝膠不能保持完整為陰性，記為“”；右側(cè)管旋轉(zhuǎn)180凝膠不變形為陽性，記為

10、“”。,舉例： 設(shè)待復(fù)核的鱟試劑標(biāo)示靈敏度為0.125EU/ml:,clg-1(X/4) lg-1（-1.22）（-0.903）（ -1.22 ）（ -1.22 ）/4 0.104（EU/ml） c在0. 52.0范圍內(nèi)，符合規(guī)定。,方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn) 目的： 確證產(chǎn)品對(duì)方法是否存在干擾（抑制或增強(qiáng)），得到供試品的最大不干擾濃度或最小不干擾稀釋倍數(shù)，為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。 影響因素： 新藥檢查方法建立； 鱟試劑批號(hào)或來源的改變； 檢品生產(chǎn)工藝，配方，成分的改變； 檢品關(guān)鍵成分來源的改變；,方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn),供試品溶液的最大稀釋倍數(shù)的計(jì)算 MVDCL/ L:供試品的內(nèi)毒素限值

11、； C：供試品溶液的濃度； 當(dāng)L以 EU/ml表示時(shí)，C為1ml/ml;當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時(shí)，C的單位為mg/ml或u/ml(注意：當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C的值不是樣品的濃度，就是1)。,方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn),內(nèi)毒素限值(L)的確定 藥典附錄有相應(yīng)計(jì)算公式，即當(dāng)今世界各國普遍采用的細(xì)菌內(nèi)毒素計(jì)算公式，即：L=K/M，式中K為按規(guī)定給藥途徑，人每公斤體重每小時(shí)可以接受的不產(chǎn)生任何不良反應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量（亦稱致熱閾），它基本上是一固定值，藥典上對(duì)每一給藥途徑的K值都有具體的規(guī)定。M為按規(guī)定的給藥途徑，人每公斤體重每小時(shí)給藥的最大劑量。這一個(gè)值的確定實(shí)際上才是計(jì)算限值的關(guān)鍵。,

12、方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾預(yù)試驗(yàn),（1）原則上一般根據(jù)藥品使用說明書或國家藥典委員會(huì)編制的臨床用藥須知來確定最大劑量。 如兒童用藥劑量大于成人用藥劑量，則以兒童劑量為準(zhǔn)。 （2）為保證安全用藥，對(duì)于抗感染、抗腫瘤、治療心血管疾病等重癥用的藥品、需聯(lián)合用藥的藥品藥品，可根據(jù)計(jì)算值適當(dāng)調(diào)整，嚴(yán)格至計(jì)算限值的1/2或1/3。,方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾試驗(yàn) 目的：驗(yàn)證預(yù)干擾中確定的濃度或倍數(shù)下的供 試品對(duì)于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。 試驗(yàn)方法：須選擇兩家以上的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn),方法學(xué)驗(yàn)證供試品干擾試驗(yàn) 結(jié)果判定： 如果有供試品和無供試品測(cè)得的鱟試劑靈敏度（c）均在0.5-2.0范圍內(nèi)時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃

13、度下不干擾試驗(yàn)，否則需要對(duì)供試品做適當(dāng)處理。 干擾的排除： 對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋； 選擇靈敏度更高的鱟試劑； 其他適宜的方法 如過濾、中和、透析或加熱處理等排除干擾。,供試品細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法檢測(cè) 檢測(cè)方法： 結(jié)果 判定 陰性 陽性 陽性 陰性,注：A 無干擾濃度供試品溶液；B 供試品陽性對(duì)照；C 陽性對(duì)照；D 陰性對(duì)照。,三、常見問題及解決方案,1、實(shí)驗(yàn)前未復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏度 鱟試劑靈敏度的改變或質(zhì)量不符合要求，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)復(fù)核鱟試劑產(chǎn)品的靈敏 2、實(shí)驗(yàn)器具的潔凈度不符合要求 一般用硫酸清潔液浸泡，用自來水沖洗干凈，再用新鮮蒸餾水沖洗三道，并干熱（250）恒溫1h即可

14、。實(shí)驗(yàn)用的玻璃器具必須嚴(yán)格無菌無熱原，建議不要使用一次性塑料制品。,3、實(shí)驗(yàn)條件達(dá)不到要求 實(shí)驗(yàn)室要求潔凈，無塵?？諝饬魍ǎ羰强照{(diào)室，應(yīng)備有一臺(tái)超凈工作臺(tái)。 4、溫度不符合要求 實(shí)驗(yàn)室溫度為252較好，恒溫水浴箱溫度為371為宜。 5、忽視樣品本身干擾,供試品若經(jīng)干擾試驗(yàn)證實(shí)存在干擾因素，可采用適宜的方法來消除干擾。消除干擾的一個(gè)重要原則是不能影響供試品中的內(nèi)毒素生物活性。 (1).供試品稀釋法 MVD=CL / 鱟試劑靈敏度()越高(數(shù)值越小)，供試品的稀釋倍數(shù)越大，干擾越小。,(2).物理方法 如加熱法(血液制品)、冷析法(甘露醇 ) (3).化學(xué)方法 如調(diào)節(jié)PH值(奎諾酮類)、調(diào)節(jié)金屬離子(血液保養(yǎng)液、FDP) (4).生物方法 如抗增液的使用，阻斷G因子反應(yīng)，防止假陽性； (5).其它方法 如過濾法、溶劑抽提等,6、鱟試劑濃度達(dá)不到要求 開啟內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和鱟試劑時(shí)，要將粘附在安瓿壁上的粉末盡可能地彈落下去。用砂輪劃過安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾異丙醇的無紡布，以避免產(chǎn)生假陽性結(jié)果）擦拭，防止開啟時(shí)玻璃屑落入安瓿內(nèi)。開啟內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，要在安瓿