氧化應(yīng)激與消化道功能的關(guān)系ppt課件

1、氧化應(yīng)激與消化道功能的關(guān)系,主 要 內(nèi) 容,氧化損傷的機(jī)理 氧化應(yīng)激與消化道損傷 抗氧化劑對(duì)氧化損傷的修復(fù)作用 展望,氧化 應(yīng)激,腸炎,腸蠕動(dòng)紊亂,急性炎癥,心血管疾病,代謝疾病,神經(jīng)紊亂,一、氧化損傷的機(jī)理,生物體在代謝過程中，產(chǎn)生許多自由基，這些自由基通常不會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷，機(jī)體依靠自身體內(nèi)的抗氧化防御體系，可以保護(hù)機(jī)體組織、細(xì)胞，防止自由基的損傷。 當(dāng)生物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基的水平高于細(xì)胞的抗氧化防御能力時(shí)，氧化還原狀態(tài)失衡，過量的自由基存在于組織或細(xì)胞內(nèi)，即誘發(fā)氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致氧化損傷。,氧化損傷 DNA氧化損傷 堿基損傷 DNA鏈的斷裂 蛋白質(zhì)過氧化 受體和酶 細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化

2、 磷脂過氧化,脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的氧化會(huì)對(duì)生物體造成不同程度的危害，從而影響機(jī)體的生長、發(fā)育、衰老等過程。急性和慢性的應(yīng)激都能通過產(chǎn)生自由基誘導(dǎo)胃腸道的氧化應(yīng)激。 其中對(duì)消化道的氧化損傷在動(dòng)物生產(chǎn)中發(fā)生率最高、隱蔽性強(qiáng)、危害性大。過量的自由基極易誘發(fā)消化道疾病，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成巨大損失。,腸道的功能： 消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì) 免疫 內(nèi)分泌 粘膜屏障 腸道粘膜是機(jī)體自身與外環(huán)境接觸的最大界面,具有選擇性滲透吸收營養(yǎng)物質(zhì)和防御腸道內(nèi)微生物及致炎因子入侵等屏障功能。,腸粘膜屏障功能 阻止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如致病微生物、抗原和促炎因子進(jìn)入血液循環(huán)的作用，從而維護(hù)動(dòng)物體健康。 當(dāng)此功能由于各種原因如感染、缺

3、血、燒傷、急性胰腺炎等而損傷時(shí)，即可引起腸粘膜通透性增高，進(jìn)一步引起腸道細(xì)菌移位和促炎因子大量釋放，從而加重原發(fā)疾病，甚至誘發(fā)多臟器功能紊亂和衰竭的發(fā)生。,腸粘膜屏障構(gòu)成 機(jī)械屏障 化學(xué)屏障 生物屏障 免疫屏障,機(jī)械屏障 機(jī)械屏障主要由緊密連接的粘膜上皮細(xì)胞以及鞘液凝膠層組成。,化學(xué)屏障 主要是胃酸、膽汁酸、粘液、溶菌酶、乳鐵蛋白和各種消化酶等對(duì)阻止致病因子入侵，維護(hù)腸粘膜屏障具有重要作用。,生物屏障 在生理狀態(tài)下機(jī)體的腸道存在大量共生細(xì)菌，它們通過分泌細(xì)菌毒素、產(chǎn)生短鏈脂肪酸、促進(jìn)腸蠕動(dòng)、占據(jù)致病菌粘附位點(diǎn)以及爭(zhēng)奪營養(yǎng)素等多個(gè)環(huán)節(jié)防止有害細(xì)菌的侵入，維護(hù)動(dòng)物體健康。而保持菌群間合適的數(shù)量與比

4、例，對(duì)于維護(hù)腸粘膜屏障的完整性至關(guān)重要。,免疫屏障 腸道相關(guān)淋巴組織包括腸集合淋巴小節(jié)，固有膜淋巴細(xì)胞和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官，在腸道執(zhí)行局部免疫功能，并與其它因素協(xié)同作用，維護(hù)腸粘膜屏障功能。,二、氧化應(yīng)激與消化道損傷,氧化應(yīng)激產(chǎn)生自由基直接作用于細(xì)胞發(fā)揮作用。 主要有四種致細(xì)胞損傷機(jī)制： 1）對(duì)脂類和細(xì)胞膜的破壞,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 2）對(duì)蛋白質(zhì)、酶的損傷,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,功能喪失和酶失活。 3）對(duì)核酸和染色體的破壞,從而導(dǎo)致DNA鏈的斷裂,染色體的畸變和斷裂。 4）對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的破壞,從而使細(xì)胞外基質(zhì)變得疏松,彈性降低。,對(duì)消化道粘膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的損傷 腸粘膜中的細(xì)胞膜過

5、脂質(zhì)氧化，損傷腸粘膜組織，腸粘液層變薄、絨毛變短、絨毛表面積減少、隱窩變淺，過氧化物和自由基刺激腸道腺體分泌，引起腸炎的發(fā)生，而腹瀉又加劇了腸道粘膜組織的損傷程度。,氧化應(yīng)激對(duì)消化道功能的影響,對(duì)消化道屏障和吸收功能的影響 當(dāng)腸道內(nèi)氧自由基增加時(shí)，會(huì)使腸道中耐受能力較弱的乳酸菌數(shù)量減少，大腸桿菌的數(shù)量上升。 營養(yǎng)素的吸收依賴于腸吸收細(xì)胞膜完整性，腸粘膜損傷，致使大量吸收細(xì)胞受到破壞，嚴(yán)重影響小腸吸收功能。,對(duì)腺體的功能影響 氧自由基的提高誘導(dǎo)生長抑素（somatostatin, SS）的分泌，SS具有廣泛的內(nèi)分泌抑制作用，抑制生長激素、生長調(diào)節(jié)素C以及多種胃腸道激素。 仔豬斷奶后，攝入的豆類蛋

6、白種胰蛋白酶抑制因子會(huì)引起胰腺炎癥，導(dǎo)致與消化功能紊亂。,正常大鼠腸結(jié)構(gòu),馬可，2006,靜脈注射LPS后腸道病理變化,對(duì)照組 誘導(dǎo)組 修復(fù)組 對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)組和復(fù)合抗氧化劑修復(fù)組空腸光鏡照片(4),趙珂立，待發(fā)表,胃潰瘍 慢性胃炎 消化性潰瘍 胃癌 結(jié)腸疾病,自由基與胃腸道疾病,氧自由基學(xué)說認(rèn)為：幽門螺旋桿菌(Hp)致慢性胃炎的主要因素之一，而其誘發(fā)機(jī)制可能同氧自由基有關(guān)。,與自由基有關(guān)，其中主要與NO及O2-有關(guān)，氧自由基能直接作用于細(xì)胞的大分子，同時(shí)可作為細(xì)胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)引起細(xì)胞漿內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子(如NF-kB)激活，引起核內(nèi)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄增加。是很多急性、慢性炎癥及免疫失調(diào)等疾病發(fā)生

7、發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。,人和動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，病變腸黏膜中ROS產(chǎn)生明顯增多，ROS同疾病活動(dòng)性相關(guān)。,在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)給予自由基清除劑可以預(yù)防難治性潰瘍復(fù)發(fā)，促進(jìn)其愈合。,流行病學(xué)調(diào)查揭示，抗氧化劑如維生素C和維生素E的缺乏與胃癌發(fā)生有關(guān)。補(bǔ)充維生素C可減少胃粘膜中的DNA損害。,氧化損傷的檢測(cè)方法,直接檢測(cè)法 電子自旋共振法 又稱電子自旋共振( electron sp in resonance, ESR) , 是反應(yīng)活性高、壽命短的自由基最直接最有效的測(cè)定方法。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高,能檢測(cè)到絕大多數(shù)的自由基。 缺點(diǎn)：自旋波譜儀價(jià)格昂貴,操作復(fù)雜, 在普通實(shí)驗(yàn)室中難以推廣。,電子自旋共振波譜儀,化

8、學(xué)發(fā)光法 常用魯米諾( luminol, 5-胺基-鄰苯二甲酰環(huán)肼) 、光澤精等作為發(fā)光增效劑。其原理為,魯米諾被ROS自由基氧化成激發(fā)態(tài)的氨基肽鹽離子,當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)放出大量光子,從而對(duì)化學(xué)發(fā)光起放大作用。 操作簡(jiǎn)單,價(jià)格低廉,目前被廣泛用于ROS的檢測(cè)和研究。,間接 測(cè)定法 脂質(zhì)過氧化損傷的測(cè)定 測(cè)定丙二醛的量常常可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映出細(xì)胞損傷的程度。常用硫代巴比妥酸法來測(cè)定丙二醛含量,此法是應(yīng)用最多也是最古老的方法。,DNA氧化損傷的檢測(cè) DNA被氧化時(shí),鳥苷酸的C-8是最易發(fā)生損傷的位點(diǎn)。因而,由此形成的8-羥基脫氧鳥苷是評(píng)價(jià)DNA氧化損傷最常使用的生物標(biāo)志物。 8-

9、羥基脫氧鳥苷的特異性單克隆抗體，彗星實(shí)驗(yàn)又稱單細(xì)胞凝膠電泳。,蛋白質(zhì)氧化損傷的檢測(cè) 其傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)是使用二硝基苯肼的比色法,使用分光光度法或者酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定2, 4-二硝基苯肼與蛋白質(zhì)羰基反應(yīng)生成的腙,來衡量蛋白質(zhì)的損傷情況。,抗氧化酶類的檢測(cè) 超氧化物歧化酶的檢測(cè)SOD SOD能通過歧化作用清除氧自由基，測(cè)定SOD的活力可間接反應(yīng)組織細(xì)胞抗氧化損傷、機(jī)體清除自由基的能力。直接法和間接法,包括電泳法、免疫法、ESR 法、化學(xué)發(fā)光法、脈沖輻解法、紫外分光光度計(jì)法等。,谷胱甘肽過氧化物酶的測(cè)定 是一種抗氧化酶, 在氧化應(yīng)激條件下,其在細(xì)胞的濃度明顯減少。 可采用紫外分光光度計(jì)法、分光光度法或

10、者酶聯(lián)免疫吸附法等進(jìn)行測(cè)定。,過氧化氫酶的測(cè)定 過氧化氫酶是一種酶類清除劑，其機(jī)制實(shí)質(zhì)上是過氧化氫的歧化,必須有兩個(gè)過氫化氫先后與過氧化氫酶相遇且碰撞在活性中心上,才能發(fā)生反應(yīng)。過氧化氫濃度越高,分解速度越快。一般也采用紫外分光光度法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。,氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法 氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)主要通過光鏡伊紅染色或吉姆薩染色和電鏡對(duì)凋亡的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察,可觀察到染色質(zhì)濃縮,核膜起皺破裂,凋亡小體形成等,以判別細(xì)胞凋亡。,磷脂酰絲氨酸外翻分析ROS致細(xì)胞凋亡的早期改變之一是細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)向細(xì)胞膜外。膜粘連蛋白5對(duì)轉(zhuǎn)向到細(xì)胞膜外的細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸有高度的親和

11、性。用異硫氰酸熒光素標(biāo)記膜粘連蛋白5,結(jié)合使用碘化丙啶對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色,即可區(qū)別凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞。,DNA片斷化檢測(cè) 氧化應(yīng)激致細(xì)胞凋亡時(shí)，其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA斷裂,形成50300kb長的DNA大片段,或者180200bp 整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 健康活細(xì)胞DNA電泳為一條區(qū)帶,而凋亡細(xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)特征性的階梯狀條帶。有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種。,陳群，2007,應(yīng)激24h細(xì)胞DNA瓊脂糖電泳圖,氧化損傷致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的檢測(cè) Bcl-2基因的檢測(cè)： Bcl-2的過度表達(dá)能阻抑多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá),如caspase23 的表達(dá)。測(cè)定方法主要有印跡雜交和實(shí)

12、時(shí)熒光定量法。 p53基因的檢測(cè)；是細(xì)胞生長周期中負(fù)調(diào)節(jié)因子，氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的過程必須有p53參與。常采用免疫組織化學(xué)、原位雜交等方法來檢測(cè)。 核因子kB基因的檢測(cè)（NF-kB）：在正常情況下是復(fù)合物，氧化應(yīng)激狀態(tài)下,NF-kB從復(fù)合體中解離并向核內(nèi)移動(dòng),與位于核內(nèi)的基因序列上特異性調(diào)控區(qū)結(jié)合,從而激活受調(diào)控的基因表達(dá)。免疫化學(xué)染色法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、原位雜交法。,三、抗氧化劑對(duì)氧化損傷的修復(fù)作用,抗氧化物質(zhì)主要的作用機(jī)制： 通過提供活性基團(tuán)，作為供氫體與自由基反應(yīng)，使之形成相應(yīng)的離子或分子，滅活自由基，終止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 提高抗氧化酶活性，降低膜的流動(dòng)性，從而降低自由基反應(yīng)，達(dá)到抑制脂質(zhì)過氧化作用。,酶類抗氧化劑 超氧化物歧化酶(SOD) 谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px) 過氧化氫酶(CAT) 非酶類抗氧化劑 VE 硒 VC 新型天然抗氧化劑 茶多酚 類黃酮 中草藥 微生物源性抗氧化劑,酶類抗氧化劑對(duì)各自由基的作用示意圖,韓雪，2010,不同抗氧化劑對(duì)應(yīng)激小鼠增重的影響,不同抗氧化劑對(duì)力竭游泳后小鼠血清中SOD活性的影響,韓雪，2010,不同抗氧化劑對(duì)力竭游泳后小鼠血清中MDA含量的影響,韓雪，2010,不同抗氧化劑對(duì)力竭游泳后小鼠肝臟中CAT活性的影響,韓雪，2010,復(fù)合抗氧化劑對(duì)LPS損傷大鼠體重的影響