除菌過(guò)濾驗(yàn)證—細(xì)菌截留試驗(yàn)課件

1、技術(shù)報(bào)告No. 26 (2008 修訂版),Celebrating over 65 Years of Connecting People, Science and RegulationSM,除菌過(guò)濾器的驗(yàn)證 細(xì)菌的截留 第6.0部分,液體的除菌過(guò)濾,1,PPT學(xué)習(xí)交流,第 6.0部分 除菌過(guò)濾器的驗(yàn)證 / 細(xì)菌的截留,6.1 影響微生物截留的因素 6.2 細(xì)菌截留驗(yàn)證研究需要考慮的方面 6.3 挑戰(zhàn)細(xì)菌的選擇 6.4 培養(yǎng)的保持 6.5 培養(yǎng)條件和標(biāo)準(zhǔn) 6.6 有效挑戰(zhàn)濃度 6.7 挑戰(zhàn)水平 6.8 聚集 6.9 培養(yǎng)物的生存能力 6.10 挑戰(zhàn)試驗(yàn)方法,6.11 試驗(yàn)用微生物的生存能力 6.

2、12 試驗(yàn)步驟和方案 6.13 非殺菌過(guò)程和液體 6.14 替代液體 6.15 殺菌液體 6.16 過(guò)濾介質(zhì)vs.裝置 6.17 壓力/流量 6.18 持續(xù)時(shí)間 6.19 下游取樣 6.20 試驗(yàn)用膜的選擇 6.21 結(jié)果的解釋 6.22 產(chǎn)品的生物負(fù)荷 6.23 過(guò)濾器構(gòu)造的改變,目 錄,2,PPT學(xué)習(xí)交流,除菌級(jí)性能的基本解釋,除菌過(guò)濾是在對(duì)產(chǎn)品沒(méi)有不良影響的前提下從流動(dòng)的液體中去除微生物的過(guò)程。 ASTMF 838-05 是一種標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)置TM，可以用于比較所有滅菌級(jí)的膜。 證明能去除一種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)細(xì)菌(Brevundimonas diminuta) 最低濃度為107 cfu/cm2 這是一

3、個(gè)很好的開(kāi)始，但是還要考慮其他因素,3,PPT學(xué)習(xí)交流,重要參考 ASTM F 838-05,ASTM 標(biāo)準(zhǔn) F838-05, “決定液體過(guò)濾器過(guò)濾膜細(xì)菌截留性能的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法”, 賓州Conshohocken美國(guó)測(cè)試和材料協(xié)會(huì) ASTM 委員會(huì) D19(2005),4,PPT學(xué)習(xí)交流,除菌級(jí)表現(xiàn)的基本定義,2008 版 TR 26 進(jìn)一步描述了過(guò)濾器驗(yàn)證需要考慮的方面除菌過(guò)濾器驗(yàn)證要考慮的兩個(gè)重要因素: 通過(guò)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)或同等的方法進(jìn)行細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)來(lái)決定過(guò)濾器膜的級(jí)別。 由過(guò)濾器的使用者或指定的測(cè)試機(jī)構(gòu)（例如：過(guò)濾器生產(chǎn)商或契約實(shí)驗(yàn)室） 使用一種代表性的挑戰(zhàn)微生物證明能完全去除一種產(chǎn)品或一

4、組產(chǎn)品上的細(xì)菌。 在進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)前，具有每組產(chǎn)品是按照適當(dāng)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的規(guī)定生產(chǎn)和檢驗(yàn)的科學(xué)依據(jù)。,5,PPT學(xué)習(xí)交流,挑戰(zhàn)微生物的選擇,以前一直推薦用 Pseudomonas diminuta 作為驗(yàn)證0.22 m 除菌級(jí)過(guò)濾器的細(xì)菌之選。 Pseudomonas diminuta 最近基于DNA的相同性被重新劃分為Brevundimonas diminuta FDA并沒(méi)有統(tǒng)一推薦某種細(xì)菌用于細(xì)菌截留試驗(yàn) 細(xì)菌大小應(yīng)能通過(guò) 0.45 m 過(guò)濾器 其他符合要求的細(xì)菌也能被接受,6,PPT學(xué)習(xí)交流,時(shí)間,影響細(xì)菌截留的因素,微生物,大小,形狀,產(chǎn)品,pH,滲透壓,離子強(qiáng)度,表面活性劑,膜,孔徑分布,

5、表面化學(xué)成分,微孔結(jié)構(gòu),P,流量,溫度,Section 6/6.1,產(chǎn)品,7,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,對(duì)過(guò)濾過(guò)程進(jìn)行詳盡的評(píng)估，包括： 溶劑的性質(zhì) (如：水的，酸性的，堿性的, 有機(jī)的) 過(guò)濾時(shí)間 過(guò)程壓力 過(guò)程流量 過(guò)程溫度 過(guò)濾器設(shè)計(jì)說(shuō)明 簽約細(xì)菌截留試驗(yàn)，三大廠家會(huì)給一個(gè)POP文件 Satorious的所有試驗(yàn)都在德國(guó)，millipore的析出物試驗(yàn)在美國(guó)。,Section 6.2,8,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,產(chǎn)品細(xì)菌截留驗(yàn)證研究應(yīng)該包括多個(gè)過(guò)濾膜 (通常三個(gè)) 。最接近泡點(diǎn)的過(guò)濾膜做這個(gè)試驗(yàn)。市場(chǎng)流通的過(guò)濾器基本泡點(diǎn)都會(huì)比較高 在產(chǎn)品可能對(duì)膜造成

6、傷害的情況下，膜的確切數(shù)量和測(cè)試設(shè)計(jì)取決于過(guò)程。,Section 6.2,9,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,用于細(xì)菌截留驗(yàn)證試驗(yàn)的三個(gè)膜中至少有一個(gè)膜應(yīng)該在試驗(yàn)前或使用前物理完整性測(cè)試數(shù)值達(dá)到或接近過(guò)濾器生產(chǎn)商的測(cè)試要求。 可能無(wú)法獲得達(dá)到或接近過(guò)濾器生產(chǎn)商要求的膜 在這種情況下，應(yīng)該從一批使用前完整性測(cè)試數(shù)值盡量低的膜產(chǎn)品中選取測(cè)試膜。 然后根據(jù)（驗(yàn)證研究中）使用前物理完整性測(cè)試數(shù)值最接近生產(chǎn)商要求的膜來(lái)確定一個(gè)特定過(guò)濾過(guò)程的完整性測(cè)試要求,Section 6.2,10,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,測(cè)試報(bào)告中應(yīng)該包括細(xì)菌截留驗(yàn)證研究中得到的膜物理完整性測(cè)試值。

7、應(yīng)在挑戰(zhàn)測(cè)試前使用水、產(chǎn)品或其他有說(shuō)明的液體來(lái)確定物理完整性,Section 6.2,11,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,應(yīng)該在產(chǎn)品細(xì)菌挑戰(zhàn)后調(diào)查測(cè)試微生物是否在過(guò)濾器的下游重現(xiàn)。 如果調(diào)查確認(rèn)測(cè)試微生物穿過(guò)了過(guò)濾器，并且過(guò)濾器達(dá)到了完整性測(cè)試要求 那么應(yīng)重新考慮該過(guò)濾器是否適合于這樣的過(guò)程條件。,Section 6.2,12,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面,成分相同、只有濃度不同的系列產(chǎn)品可以通過(guò)挑戰(zhàn)極限濃度和接受中間一組濃度來(lái)驗(yàn)證。 如果某個(gè)單個(gè)產(chǎn)品被認(rèn)為是最差情況代表，則應(yīng)伴有依據(jù)和數(shù)據(jù)。,Section 6.2,13,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留驗(yàn)證需要考慮的方面

8、,一般來(lái)說(shuō)重復(fù)使用過(guò)濾器是不實(shí)際的，或者說(shuō)不建議用于制藥生產(chǎn) 但是如果重復(fù)使用除菌級(jí)過(guò)濾器 應(yīng)該給出理由，并且重復(fù)使用參數(shù)應(yīng)該經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。,14,PPT學(xué)習(xí)交流,測(cè)試設(shè)計(jì)的兩種方法,1. 直接接種法 2. 修改法 有時(shí)被稱為: 間接法 兩步法 再循環(huán)法,15,PPT學(xué)習(xí)交流,1. 直接注入細(xì)菌法,直接接種測(cè)試,藥品,可存活 微生物?,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,測(cè)試過(guò)濾器,泵,化驗(yàn)濾出液 的微生物,16,PPT學(xué)習(xí)交流,2. 間接法,藥品,可存活 微生物?,化驗(yàn)濾出液 的微生物,否,改變 產(chǎn)品/過(guò)程,預(yù)處理過(guò)濾器,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,泵,測(cè)試過(guò)濾器,抗生素 防腐劑

9、 溫度 pH,1,2,17,PPT學(xué)習(xí)交流,預(yù)處理,時(shí)間 溫度 化學(xué)性質(zhì),壓力 流量,使過(guò)濾器暴露于實(shí)際的產(chǎn)品和過(guò)程條件中,抑制配方 預(yù)處理注入物,1,2,沖洗緩沖器: 去除過(guò)濾器的毒殺活動(dòng),維持全部 過(guò)程條件,驗(yàn)證此步驟 確保細(xì)菌活性,18,PPT學(xué)習(xí)交流,修改產(chǎn)品、過(guò)程的兩個(gè)例子,8 小時(shí)過(guò)程時(shí)間 殺菌產(chǎn)品,預(yù)處理8 小時(shí),修改過(guò)的產(chǎn)品 8小時(shí),預(yù)處理,截留測(cè)試,預(yù)處理4小時(shí),實(shí)際的產(chǎn)品 4小時(shí),沖洗,19,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留研究的一般圖示,20,PPT學(xué)習(xí)交流,細(xì)菌截留研究的一般圖示,接種挑戰(zhàn)溶液的再循環(huán),21,PPT學(xué)習(xí)交流,研究設(shè)計(jì)決策樹(shù),22,PPT學(xué)習(xí)交流,Validati

10、on Strategy Study Design,23,PPT學(xué)習(xí)交流,Validation Strategy Study Design,Ideal Method / Approach,24,PPT學(xué)習(xí)交流,Validation Strategy Study Design,Alternative Approach,25,PPT學(xué)習(xí)交流,Validation Strategy Study Design,26,PPT學(xué)習(xí)交流,挑戰(zhàn)微生物的選擇 - 1.,推薦選擇Brevundimonas diminuta 作為用于除菌級(jí)過(guò)濾器驗(yàn)證的微生物。 但是: 請(qǐng)明白FDA或其他法規(guī)機(jī)構(gòu)并沒(méi)有推薦某一種微生物

11、作為用于驗(yàn)證的唯一微生物。 微生物的尺寸應(yīng)小到能通過(guò) 0.45 m 的過(guò)濾器 其他符合要求的微生物也可以接受。 必須建立挑戰(zhàn)細(xì)菌符合要求的模型 必須清楚過(guò)程中的生物負(fù)荷對(duì)所選擇細(xì)菌的影響,27,PPT學(xué)習(xí)交流,挑戰(zhàn)微生物的選擇 - 2.,推薦選擇Brevundimonas diminuta 作為用于除菌級(jí)過(guò)濾器驗(yàn)證的微生物。 目前應(yīng)用的培養(yǎng)方法有兩種: 肉湯法 (Leahy and Sullivan, 1978) 凍膏法 (Fennington Jr. and Howard Jr., 1997) 兩者都符合現(xiàn)行工業(yè)標(biāo)準(zhǔn),28,PPT學(xué)習(xí)交流,有效挑戰(zhàn)濃度,過(guò)濾后應(yīng)該 過(guò)濾器測(cè)試膜每平方厘米表面

12、達(dá)到至少107 個(gè)微生物 均勻分布于膜的表面是最理想的 挑戰(zhàn)濃度 (cfu/mL) 和挑戰(zhàn)水平 (cfu/cm2).是不同的，不可混淆,29,PPT學(xué)習(xí)交流,有效的挑戰(zhàn)水平,最低挑戰(zhàn)水平應(yīng)為每平方厘米膜表面至少 107 cfu B. diminuta (或生物負(fù)荷) 基于Bowman對(duì)0.45 m過(guò)濾器的觀察 Bowman et al., J. Pharm. Sci., 56: 222 (1967) 0.45 m 過(guò)濾器截留數(shù)量 104-106 cfu/cm2 檢查過(guò)大的孔 “除菌級(jí)”的定義,30,PPT學(xué)習(xí)交流,聚集,單分散性的細(xì)胞最適用于挑戰(zhàn) 用光學(xué)顯微鏡甄選菌株 使用超聲波/振動(dòng)使其散開(kāi)

13、 通過(guò)光學(xué)顯微鏡和存活計(jì)數(shù)予以確定 使用 0.45 m過(guò)濾器作為過(guò)濾器挑戰(zhàn)測(cè)試中的陽(yáng)性對(duì)照措施。,31,PPT學(xué)習(xí)交流,測(cè)試微生物的活性,確認(rèn)挑戰(zhàn)液體中微生物的活性 藥物產(chǎn)品或替代物 微生物必須在整個(gè)挑戰(zhàn)測(cè)試的過(guò)程中是存活的 如果損失了10倍的微生物，可能就不適合采用直接接種法來(lái)進(jìn)行挑戰(zhàn)測(cè)試。 挑戰(zhàn)前后確定活性 使用可接受的微生物學(xué)方法，如 標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)，用于上游分析 方法必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證 (暗示) 使用相同的培養(yǎng)基分析濾出液中細(xì)菌存在的情況。 Section 6.9/6.11,32,PPT學(xué)習(xí)交流,抑菌/殺菌/非分散溶液,由于直接接種法是理想的 由于測(cè)試微生物活性的一些問(wèn)題，一個(gè)成功的測(cè)試計(jì)劃可

14、能需要改變 挑戰(zhàn)液體 挑戰(zhàn)條件 或兩者兼有 可能需要預(yù)處理過(guò)濾器 文件給出了定義毒性水平的指南,33,PPT學(xué)習(xí)交流,2. 直接法,可存活的 微生物?,否,改變 產(chǎn)品/過(guò)程,預(yù)處理過(guò)濾器,B. Diminuta / 挑戰(zhàn)微生物,泵,測(cè)試過(guò)濾器,抗生素 防腐劑 溫度 pH,1,2,藥品,化驗(yàn)濾出液 中的微生物,34,PPT學(xué)習(xí)交流,產(chǎn)品或過(guò)程的改變: 抑菌/殺菌溶液,概述 決策過(guò)程一般不能被很好地理解。 圖2 給出了大概的指南 首選始終是直接接種法。 第二個(gè)選擇是改變產(chǎn)品/過(guò)程。 預(yù)處理過(guò)濾器需要與改變產(chǎn)品/過(guò)程結(jié)合起來(lái)進(jìn)行。 文件提供了關(guān)于定義毒性水平的指南 (毒性大于 1 log) 文件沒(méi)有

15、試圖把改變產(chǎn)品或程序的方法區(qū)分優(yōu)先次序 必須科學(xué)地使決策合理化。,Section 6.15,35,PPT學(xué)習(xí)交流,壓差和流量,應(yīng)包括最大過(guò)程條件 達(dá)到或超過(guò)已知壓差 達(dá)到或超過(guò)已知流量 也許不能在小范圍內(nèi)同時(shí)模擬兩者。 使用者決定哪個(gè)與特定的過(guò)程更相關(guān) 建立支持決策的理由,Section 6.17,36,PPT學(xué)習(xí)交流,化驗(yàn)和結(jié)果解釋,可以用0.45 或 0.22 m過(guò)濾器從濾出液中回收微生物。 所有的濾出液必須經(jīng)過(guò)化驗(yàn) 要認(rèn)為一個(gè)過(guò)濾器對(duì)于某個(gè)過(guò)程來(lái)說(shuō)是滅菌級(jí)別: 測(cè)試過(guò)濾器不能允許任何微生物通過(guò) 所有的陽(yáng)性和陰性對(duì)照措施必須是有效的。 為確定微生物穿過(guò)了過(guò)濾器而進(jìn)行重復(fù)測(cè)試是允許的,37,

16、PPT學(xué)習(xí)交流,產(chǎn)品的生物負(fù)荷,產(chǎn)品的生物負(fù)荷必須經(jīng) 辨認(rèn) 確定特征 確定數(shù)量 過(guò)濾器生物負(fù)荷(即挑戰(zhàn)水平)的計(jì)算 過(guò)濾器生物負(fù)荷=BV/A，那么 B = 微生物計(jì)數(shù) (cfu/mL) V = 總體積 (ml) A = 過(guò)濾器總表面積 (cm2) 過(guò)濾器生物負(fù)荷單位是cfu/cm2 允許使用者拿生產(chǎn)過(guò)濾器生物負(fù)荷與標(biāo)準(zhǔn)挑戰(zhàn)測(cè)試生物負(fù)荷（107 cfu/cm2)相比較。 Section 6.22,38,PPT學(xué)習(xí)交流,設(shè)備測(cè)試的原理： 評(píng)估過(guò)濾器裝置的完整性,要考慮到生產(chǎn)出來(lái)的裝置可能沒(méi)有截留作用 膜未封閉好 膜遭到了破壞 構(gòu)件相交之處膜有缺陷 要考慮到不能依賴完整性測(cè)試檢查出設(shè)備在生產(chǎn)過(guò)程中形

17、成的缺陷。,39,PPT學(xué)習(xí)交流,濾介體 vs. 裝置,選擇膜盤還是裝置取決于驗(yàn)證操作的目的 如果目的是驗(yàn)證膜的截留性能，那么使用膜盤進(jìn)行縮小比例試驗(yàn) 完整性測(cè)試的方法必須有意義: 如: 建立泡點(diǎn)和擴(kuò)散流之間的關(guān)系 膜的完整性在安放膜的時(shí)候得以建立，在裝置測(cè)試中得以確認(rèn)。,40,PPT學(xué)習(xí)交流,擴(kuò)大試驗(yàn):濾介體 vs. 裝置,膜盤是適用于驗(yàn)證過(guò)程過(guò)濾裝置某些特征的一種模型。 過(guò)濾裝置必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證才能應(yīng)用于生產(chǎn)過(guò)程中。,Section 6.16,41,PPT學(xué)習(xí)交流,盤測(cè)試的原因: 確保過(guò)濾裝置完整性,過(guò)濾器最初的和過(guò)程中的完整性通過(guò)以下手段得以充分保證 證明過(guò)濾器與過(guò)程相匹配的充分研究 過(guò)濾器

18、生產(chǎn)商質(zhì)量系統(tǒng)審查 經(jīng)驗(yàn)證的完整性測(cè)試 于過(guò)濾器使用前后恰當(dāng)?shù)貓?zhí)行,42,PPT學(xué)習(xí)交流,壓差和流量,應(yīng)包括最大過(guò)程條件 達(dá)到或超過(guò)已知壓差 達(dá)到或超過(guò)已知流量 也許不能在小范圍內(nèi)同時(shí)模擬兩者。 使用者決定哪個(gè)與特定的過(guò)程更相關(guān) 建立支持決策的理由,43,PPT學(xué)習(xí)交流,化驗(yàn)?zāi)さ倪x擇,通常兩者均可 0.45 m 或 0.22 m 用額定的分析過(guò)濾器回收測(cè)試微生物 一篇發(fā)表的論文支持使用0.45 m過(guò)濾器(J. Carter, PDA-JPST, Volume 50, No.3, 1996) 化驗(yàn)過(guò)濾器的選擇應(yīng)該經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,44,PPT學(xué)習(xí)交流,產(chǎn)品生物負(fù)荷,驗(yàn)證設(shè)計(jì)必須考慮最初的生物負(fù)荷 辨認(rèn) 確定特征 確定數(shù)量 過(guò)濾器生物負(fù)荷的計(jì)算 B = BV/A 在這里 B = 微生物計(jì)數(shù) (cfu/mL) V = 總體積 (mL) A = 過(guò)濾器總表面積 (cm2) 使用B. diminuta假定用過(guò)濾的方法去除自然生物負(fù)荷微生物更難。,area,45,PPT學(xué)習(xí)交流,生物負(fù)荷,Brevundimonas diminuta 對(duì)比 自然生物負(fù)荷試驗(yàn),標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法 (ASTM) 小細(xì)胞 單分散性的