基因工程-第三章-基因工程的載體

第三章基因工程的載體載體：攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的工具用于基因工程的載體細(xì)菌質(zhì)粒載體噬菌體λ衍生載體Cosmid載體Phagemid載體酵母質(zhì)粒載體真核病毒載體Bacmid載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新發(fā)展概況

1.

第一階段（1977年前）：天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二階段：增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

3.第三階段：進(jìn)一步完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動(dòng)子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體的基本功能1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三章基因工程的載體作為基因工程載體必須具備的基本條件1.具有對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有多種單一的酶切位點(diǎn)5.具有合適的選擇性標(biāo)記1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新遺傳標(biāo)記基因

1.標(biāo)記基因的作用

1）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

這種指示可以是選擇性的（Apr

，Tcr

，Kanr），也可以是非選擇性的（如lacZ）

2）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。

*這種指示也可以是選擇性的（如TcS），也可以是非選擇性的（如TcS，

lacZα,GUS），絕大多數(shù)為后者。

**有的遺傳標(biāo)記基因可以完成上述兩項(xiàng)作用。當(dāng)充任第一作用時(shí)，最好是選擇性標(biāo)記基因；當(dāng)完成第二作用時(shí)，目前多采用非選擇性的—檢測(cè)性標(biāo)記基因。有的基因是不能用作選擇性標(biāo)記基因（lacZ，GUS等）。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2.

標(biāo)記基因的種類

1）抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr

，Cmr，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cd

rc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2）營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3）生化標(biāo)記基因

其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測(cè)的生化反應(yīng)，如lacZ,GUS,CAT

4）噬菌斑

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

3.

使用標(biāo)記基因注意要點(diǎn)

1）標(biāo)記基因與宿主細(xì)胞

2）標(biāo)記基因產(chǎn)物的作用機(jī)制:Apr3）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)與適用范圍:基因啟動(dòng)子,翻譯起始序列,密碼子偏愛性

4）標(biāo)記基因的結(jié)構(gòu)變化對(duì)功能的影響:LacZ,GUS

4.

常用的遺傳標(biāo)記基因

1)四環(huán)素抗性基因（Tcr）

Tetracycline可結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。四環(huán)素抗性基因編碼一種399AAs蛋白質(zhì)，與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，阻止四環(huán)素分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2)氨芐青霉素抗性基因（Apr）

Ampicillin可抑制細(xì)菌細(xì)胞膜上參與細(xì)胞壁合成酶類的活性。Apr抗性基因編碼一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞周間質(zhì)的酶，催化β—內(nèi)酰胺環(huán)的水解，使氨芐青霉素失活。3)氯霉素抗性基因（Cmr）

Chlorophenicol可結(jié)合在核糖體50S亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。Cmr基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素乙?；瑢?dǎo)致乙?；穆让顾夭荒芙Y(jié)合在核糖體上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均屬脫氧鏈霉胺氨基葡萄糖苷類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。來自轉(zhuǎn)座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使這類抗生素磷酸化，使之不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ

和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時(shí)，才會(huì)表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個(gè)部分可獨(dú)立存在，分別由兩個(gè)基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個(gè)基因（LacZ和LacZα）均可作為標(biāo)記基因。

β—半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn):

a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測(cè)直觀

b.lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

PLacZα

LacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβLacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物pUC18BamHI片段重組DNA分子轉(zhuǎn)化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落為重組子，蘭色菌落為原載體利用LacZ基因篩選重組子1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）

該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十分廣泛，因?yàn)樵S多生物中沒有這種基因。

7）熒光素酶基因

熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細(xì)菌（Photobacterium

fischeri）產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測(cè)定酶活。

8）發(fā)光蛋白質(zhì)基因

發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)與種類

1.復(fù)制起點(diǎn)的種類

1)核內(nèi)復(fù)制起點(diǎn)

a.染色體復(fù)制起點(diǎn)—原核生物(環(huán)狀)和真核生物(線狀)染色體

b.染色體外復(fù)制起點(diǎn)

i.質(zhì)粒—DNA,RNA,線狀,環(huán)狀,單鏈,雙鏈

ii.病毒—同上,細(xì)胞內(nèi)和病毒顆粒內(nèi)

2)核外復(fù)制起點(diǎn)

a.線粒體—所有真核細(xì)胞

b.葉綠體—所有綠色植物細(xì)胞

原核與真核生物兩種質(zhì)體中亦可能含有質(zhì)粒1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

3.按復(fù)制起點(diǎn)劃分克隆載體

1)質(zhì)粒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體

2)ARS復(fù)制型—ARS（autonomus

replicativesequence)，或稱染色體復(fù)制型

3)病毒復(fù)制型—復(fù)制起點(diǎn)來自病毒，若為RNA病毒，必須反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

4)混合復(fù)制型

a.

同種生物復(fù)制起點(diǎn)混合—質(zhì)粒形式存在；質(zhì)粒或病毒形式存在1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

例：大腸桿菌（E.coli）的噬粒（phagemid）載體既含有來自質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，又含有來自噬菌體（如M13）的復(fù)制起點(diǎn)。在不同條件下，它可以質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，從而獲得質(zhì)粒ds-DNA或噬菌體ss–DNA又如：釀酒酵母（Saccharomyces

cerevisiae）的某些載體既含有質(zhì)粒（2μ）復(fù)制起點(diǎn)，又含有ARS片段

b.

不同生物復(fù)制起點(diǎn)混合—穿梭載體（shuttlevector）兩種生物中均以質(zhì)粒形式存在；在一種生物中以質(zhì)粒形式存在，在另一種生物中以質(zhì)?；虿《拘问酱嬖?穿梭載體范圍：細(xì)菌—細(xì)菌（放線菌），細(xì)菌—酵母菌，細(xì)菌—真菌，細(xì)菌—?jiǎng)游?/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新pBS載體的結(jié)構(gòu)1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新分子克隆載體的復(fù)制起點(diǎn)種類、標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系

1.復(fù)制起點(diǎn)種類與拷貝數(shù)間的關(guān)系

1)質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)類型：低拷貝（嚴(yán)緊型，1-2copies，受宿主染色體基因控制）；高拷貝（松弛型，>20copies，受宿主染色體控制較弱）

2)ARS型載體：拷貝數(shù)較高（約20copies）

3)病毒型復(fù)制起點(diǎn)：高拷貝

2.

標(biāo)記基因與拷貝數(shù)的關(guān)系

若標(biāo)記基因表達(dá)效率高，宿主細(xì)胞可能不大量產(chǎn)生標(biāo)記基因以滿足選擇壓力要求，因而載體拷貝數(shù)會(huì)降低。對(duì)于不同標(biāo)記基因，可采取相應(yīng)方法提高其拷貝數(shù)。

如：對(duì)于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物濃度。對(duì)于營養(yǎng)標(biāo)記基因，可降低該基因的表達(dá)效率或更換其他低效率的標(biāo)記基因1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新分子克隆載體的轉(zhuǎn)化頻率和穩(wěn)定性

1.影響轉(zhuǎn)化頻率的因素

1)復(fù)制起點(diǎn)類型：盡可能選擇高拷貝復(fù)制起點(diǎn)

2)標(biāo)記基因：盡可能選擇高效表達(dá)的標(biāo)記基因

2.

影響穩(wěn)定性的因素

1)

復(fù)制起點(diǎn)類型—低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差

2)

選擇壓力

3)

載體在宿主細(xì)胞中的狀態(tài)—自主復(fù)制型和整合型宿主細(xì)胞的遺傳特性和生理特性1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)1、定義質(zhì)粒是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制的共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA）1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征自主復(fù)制性質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori）以及一個(gè)控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能獨(dú)立于宿主細(xì)胞的染色體DNA而自主復(fù)制1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征不相容性利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被導(dǎo)入同一細(xì)胞中，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中，就會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng)，幾種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細(xì)胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征可擴(kuò)增性pMB1或ColEI類質(zhì)粒在蛋白質(zhì)合成中斷時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制能持續(xù)合成，這樣當(dāng)用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制時(shí)，帶有pMB1或ColEI復(fù)制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞可以積聚2000-3000個(gè)拷貝，這叫做氯霉素?cái)U(kuò)增。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)2、特征攜帶遺傳標(biāo)記

在實(shí)驗(yàn)室中將質(zhì)粒通過物理方法導(dǎo)入受體細(xì)胞，但是即使在最佳條件下，受體細(xì)胞中也只有少數(shù)細(xì)胞能穩(wěn)定地接受質(zhì)粒，要想找到這些進(jìn)入了質(zhì)粒的受體細(xì)胞，就要利用載體質(zhì)粒上的遺傳標(biāo)記，天然質(zhì)粒上碰巧攜帶許多功能基因，它們便可被用作選擇標(biāo)記。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)3、分類

接合型和非接合型嚴(yán)緊性和松弛型在基因工程中使用的質(zhì)粒都是松弛型質(zhì)粒1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建1、理想質(zhì)粒載體所具備的條件質(zhì)粒較小質(zhì)粒帶有可供選擇的標(biāo)記帶有盡可能多的單一限制酶切位點(diǎn)應(yīng)有較高的基因表達(dá)能力1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建2、質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的

天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：（1）加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇

（2）增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組

（3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量

（4）改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝

（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件方法就是重組，拼拼接接，挖肉補(bǔ)瘡。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新多拷貝質(zhì)粒經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于擴(kuò)增外源基因。

測(cè)序質(zhì)?？截悢?shù)高，加裝測(cè)定順序所必需的序列，如多切口接頭，便于各種片段方便克隆

整合質(zhì)粒裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上

穿梭質(zhì)粒

含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制

表達(dá)質(zhì)粒裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)

探針質(zhì)粒篩選克隆或?qū)ふ一蛟ǔＱb有一個(gè)可以定量測(cè)定其表達(dá)的標(biāo)記基因，如抗性基因。篩選啟動(dòng)基因、終止子等。

人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為：1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322大?。?.3kb選擇標(biāo)記：Apr

Tcr單一酶切位點(diǎn)：EcoRⅠHindⅢBamHⅠPstⅠISalⅠ等1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建3、人工組建克隆載體-pBR322用于組建pBR322的三個(gè)親本質(zhì)粒的特征：pSE2124：Apr基因pMB8:ColEI松弛型復(fù)制子pSC101:Tcr基因1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒多拷貝大腸桿菌型質(zhì)粒，包括pUC8/9pUC18/19pUC的親本質(zhì)粒是pBR322,包括如下四個(gè)部分：來自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)（ori）來自pBR322的Apr基因（核甘酸序列已發(fā)生改變）E.coli的lacZ基因及其啟動(dòng)子組成lacZ‘基因lacZ‘內(nèi)部人工組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）它含有如下單一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒（plasmid）載體的構(gòu)建4、人工組建克隆載體-pUC系列質(zhì)粒pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)更小的相對(duì)分子量和更高的拷貝數(shù)可用組織化學(xué)法檢測(cè)重組體具有多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段是基因工程中目前最常用的E.coli克隆載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmid）的制備堿裂解法

（1）將菌體懸浮在含有EDTA的緩沖液體中

（2）加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁

（3）加NaOH與SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物

（4）加高濃度的醋酸鉀溶液沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)

（5）離心取上清液，用苯酚－氯仿溶液處理，滅活去除痕量蛋白質(zhì)及核酸酶

（6）乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒

（7）無DNase的RNase處理殘余RNA1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第一節(jié)E.coli

質(zhì)粒載體三、質(zhì)粒（plasmid）的制備沸水浴法

（1）將菌體懸浮在含有EDTA和TritonX-100的緩沖液中

（2）加溶菌酶破細(xì)胞壁

（3）放入沸水浴中煮40秒

（4）離心，用無菌牙簽挑去沉淀物

（5）乙醇異丙醇沉淀1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新一、Ti質(zhì)粒載體

1.

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium

tumefaciens)與Ti質(zhì)粒

G-菌，可侵入90科雙子葉植物受傷組織，形成冠癭瘤(crowngalltumor)。冠癭瘤細(xì)胞具有以下特征：

i.不需要補(bǔ)充植物激素便可進(jìn)行離體培養(yǎng)

ii.合成腫瘤特有的化合物—冠癭堿(opine)，能專一的為根癌農(nóng)桿菌所利用.這兩個(gè)特征由Ti質(zhì)粒決定，但該質(zhì)粒中僅有一部分進(jìn)入植物細(xì)胞。

三、其他質(zhì)粒載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1)

Ti質(zhì)粒類型（由Ti質(zhì)粒所產(chǎn)生的冠癭堿種類而定）

i.鱆魚堿類(octopine)ii.胭脂堿類(nopaline)iii.農(nóng)堿類(agropine)2)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

i.環(huán)狀ds-DNA,160-250kb，具六個(gè)功能區(qū)

i)致瘤區(qū)：合成植物生長素和細(xì)胞分裂素

ii)冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成

iii)冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解

iv)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移

v)毒（性）區(qū)：參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體

vi)DNA復(fù)制區(qū)：參與Ti質(zhì)粒DNA復(fù)制1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

ii.T-DNAT-DNA包括植物激素冠癭堿合成區(qū)基因及兩側(cè)相同的25bp重復(fù)序列，T-DNA整合不具特異性，右側(cè)25bp重復(fù)序列對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。不同Ti質(zhì)粒中的T-DNA結(jié)構(gòu)是不相同的，其中

i)胭脂堿Ti質(zhì)粒的T-DNA長23bp,結(jié)構(gòu)連續(xù)，具13個(gè)基因

ii)鱆魚堿Ti質(zhì)粒中的T-DNA不連續(xù)，分左右兩段，分別稱之為TL和TR,TLDNA長13.2kb,含8個(gè)基因，包括鱆魚堿合成酶和植物激素合成基因,TR

–DNA長7.9kb，含5個(gè)基因，參與甘露堿(mannopine)和農(nóng)堿合成

iii)兩者同源性：主要集中在植物激素合成區(qū)。

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Ti質(zhì)粒的T-DNA的同源性

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2.

Ti質(zhì)粒載體

1)Ti質(zhì)粒作為載體的問題

i)太大，無適合克隆位點(diǎn)

ii)T-DNA的存在不能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為完整植株

2)載體類型

i)中間載體(intermediatevector)

由以下幾部分組成：

適合于E.coli和A.tumefaciens自主復(fù)制和選擇用標(biāo)記基因適合于植物細(xì)胞選擇用標(biāo)記基因一段來自天然Ti質(zhì)粒的部分T-DNA序列（提供同源重組）

1-2個(gè)來自T-DNA的25bp重復(fù)序列用于表達(dá)外源基因的DNA序列（如啟動(dòng)子、終止子序列）1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

重組DNA的轉(zhuǎn)移過程：中間載體或重組子E.coli(中宿主)A.tumefaciens

在根癌農(nóng)桿菌中與天然Ti質(zhì)?；蚍侵铝鲑|(zhì)粒發(fā)生共整合作用感染植物受傷組織或與植物細(xì)胞共培養(yǎng)

T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到染色體DNA中外源基因表達(dá)轉(zhuǎn)化接合轉(zhuǎn)移

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新根癌農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Ti質(zhì)粒衍生的植物克隆載體

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新二、釀酒酵母(Saccharomycea

cerevisiae)的分子克隆載體

1.克隆載體的種類

1)

按復(fù)制方式劃分

i.

自主復(fù)制型；

ii.整合型（非自主復(fù)制型）YeastIntegrationplasmid(YIp)

2)按復(fù)制子來源劃分

i.附加體型-yeastepisomal

plasmid(YEp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自于釀酒酵母的天然質(zhì)粒-2μ質(zhì)粒

ii.染色體復(fù)制型-YeastReplicatingplasmid(YRp)，其復(fù)制起點(diǎn)來自染色體上的自主復(fù)制序列(ARS-autonomousreplicatingsequence)三、其他質(zhì)粒載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新釀酒酵母載體的種類和構(gòu)建

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

*若在YRp中插入釀酒酵母的著絲粒序列，該種載體YCp-YeastCentrometricplasmid**若在YCp

或YRp

中插入一段酵母的端粒結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒稱之為YLp-YeastLinearplasmid***若將YLp質(zhì)粒構(gòu)建成環(huán)狀分子,該質(zhì)粒稱之為pYAC載體(YeastArtificialChromosome)3)標(biāo)記基因

大多數(shù)是以酵母菌氨基酸或堿基合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因作為選擇標(biāo)記，如ARG4，LEU2，TRP1，HIS3和URA3。使用這些遺傳標(biāo)記時(shí)，受體菌應(yīng)是相應(yīng)標(biāo)記基因的突變型，且是穩(wěn)定的突變體（缺失突變或多點(diǎn)突變），利用遺傳互補(bǔ)進(jìn)行轉(zhuǎn)化體選擇的，重組子則是靠在E.coli的轉(zhuǎn)化體中來鑒別的。

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

2.酵母克隆載體的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)

1)

穿梭載體，YIp除外

2)

有適合兩種生物的標(biāo)記基因

3)

環(huán)狀或線狀DNA

詳見下表

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新載體類型存在方式所需DNA序列標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化頻率穩(wěn)定性

（菌落/μgDNA）無絲分裂有絲分裂

整合型整合與染色體DNAApr

Tcr<10+a+a

(YIp5)1-幾個(gè)拷貝同源

URA3

附加體型自主復(fù)制2μ質(zhì)粒Apr

Tcr

103-104

-b-c(YEp13)多拷貝LEU2

復(fù)制型自主復(fù)制ARSApr

Tcr

103-104-b-c(YRp7)多拷貝TRP1

著絲粒型染色體狀A(yù)RS,CENApr

103-104+d+d(YCp19)通常單拷貝TRP1,URA3

線型染色體狀A(yù)RS，CENTRP1，HIS3

103-104+e+(YLp21)通常單拷貝TEL

a.每次細(xì)胞分裂仍有約1%的載體DNA從染色體上脫落下來b.在選擇培養(yǎng)基中15-20代后，10-30%的轉(zhuǎn)化子丟失載體DNAc.非孟德爾式分離，主要是4+：0-d.無絲分裂時(shí)有3-14%轉(zhuǎn)化體丟失質(zhì)粒，有絲分裂時(shí)有3%轉(zhuǎn)化體質(zhì)粒不發(fā)生分離在選擇培養(yǎng)基上丟失質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體低于1%釀酒酵母各種載體的特征1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新3.YEp載體

1)酵母2μ質(zhì)粒

i.結(jié)構(gòu)

ii.

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

2μ質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

2μ質(zhì)粒倒置區(qū)的同向和反向重復(fù)片段1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新2）2μ質(zhì)粒載體

YIp中可插入整個(gè)或部分2μ質(zhì)粒DNA構(gòu)成YEp。大多數(shù)釀酒酵母菌株中都含有2μ質(zhì)粒，YEp復(fù)制所需的酶可由2μ質(zhì)粒提供。

YEp具有YRp載體相同的特點(diǎn)，它還可以與2μ質(zhì)粒發(fā)生重組。重組質(zhì)粒不穩(wěn)定，在無選擇壓力條件下可很快消失。利用此特點(diǎn)可除去酵母菌株中的天然質(zhì)粒，即[Cir+][Ciro]

當(dāng)YEp進(jìn)入宿主細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)化體內(nèi)所含DNA可得如下雜交圖譜（設(shè)YEp為8kb，BamHI有一單切點(diǎn)）1-YEp13探針;2-2μ質(zhì)粒探針;3-LEU2探針;4-pBR322探針1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新4.pYAC載體

酵母菌人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)廣泛用于構(gòu)建高等動(dòng)植物基因組文庫的構(gòu)建,由YLp經(jīng)適當(dāng)改造后構(gòu)建成pYAC載體。pYAC載體具有以下特點(diǎn)：

1）

雙TEL位點(diǎn)；

2）

三個(gè)酵母菌遺傳標(biāo)記基因；

3）

一個(gè)SUP4基因用于檢測(cè)重組子，其原理是：SUP4是tRNAtyr的赭色抑制突變基因，但把該基因轉(zhuǎn)入酵母菌的ade2赭色突變體時(shí)，宿主菌為白色菌落，要是在SUP4基因中插入外源DNA片段后在轉(zhuǎn)化ade2宿主菌，轉(zhuǎn)化子成紅色菌落。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新YAC:酵母人工染色體（yeastartificialchromosome）目前能容納最大外源DNA片斷的載體.YAC載體有兩個(gè)臂，每個(gè)臂的末端有一個(gè)端粒（TEL），臂上有著絲粒（CEN）、自主復(fù)制序列（ARS）、選擇標(biāo)記（TRP1和URA3）裝載容量：50Kb---2000KbYAC載體是以質(zhì)粒的形式出現(xiàn)，如：pYAC21/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新pYAC載體的結(jié)構(gòu)1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體一、l噬菌體的分子生物學(xué)l噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和lDNA組成1.l-DNA的物理圖譜

l-DNA為線狀雙鏈DNA分子，兩端各有一個(gè)12核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘性末端），稱為cos區(qū)，全長48.5kb。

左邊是外殼蛋白的基因，右邊是負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞，DNA自主復(fù)制以及調(diào)控基因，中間是負(fù)責(zé)與宿主染色體DNA遺傳重組整合的基因1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cI

cro

cIIOPQSR

att

int

xis

gamredcIIINCOS

COS

頭部基因尾部基因功能不明區(qū)

溶源化重組早期控制阻遏

DNA合成溶菌生長非必須區(qū)段cI基因：溶源過程控制基因。λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephage

cosendsCircularformLinearform1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體一、l噬菌體的分子生物學(xué)1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

溶源階段

(整合到寄主染色體上)48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphage1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建天然的l－DNA由于包裝上下限的存在以及同種酶切口太多不適合作為重組實(shí)驗(yàn)的載體1.縮短長度

野生型l－DNA包裝的上限為50.9kb，本身長度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。其實(shí)l－DNA上約有40-50%的DNA片段（J-N區(qū)間）是復(fù)制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建縮短長度

插入型載體

該類載體經(jīng)改造后的長度為37kb，有單一酶切位點(diǎn)，便于外源DNA的插入。其允許插入片段最大為13.9kb。根據(jù)插入失活效應(yīng)的特異性分為兩種亞型：免疫功能失活插入型載體β－半乳糖苷酶失活插入型載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新插入式載體：

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

lacZLA19.9RA21.9EcoRI

Charon

16A1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建縮短長度

替換型載體（取代型載體）

該類載體經(jīng)改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），兩者間的距離為14kb長，使用時(shí)用酶切開，分離去除這個(gè)14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Lac

5

EcoRI

EcoRIEcoR

IBamHISalISalIBamHIEcoRICharon4AEMBL3/4Charon

401/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建刪除重復(fù)的酶切口插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個(gè)酶切口，多了也不行天然的l-DNA上有許多重復(fù)的酶切口，如：EcoRI5個(gè)，HindIII7個(gè)，這些多余的酶切口必須被刪除。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體二、l噬菌體載體的構(gòu)建構(gòu)建琥珀型密碼子突變體

終止密碼子有三種：UAA（赭石）；UGA（乳白）；UAG（琥珀）

琥珀型突變：CAG-UAG（stop）

將野生型λ-DNA上A和B兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變成UAG，當(dāng)這種l-DNA進(jìn)入一般大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的A和B頭部蛋白，也就不能被包裝，不能裂解細(xì)菌。阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第二節(jié)λ噬菌體載體三、l-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌l-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組l-DNA的篩選較為方便4.重組l-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三節(jié)

Cosmid載體一、Cosmid的定義

Cosmid（cossite—carryingplasmid）：是一類由人工構(gòu)建的含有l(wèi)-DNA兩端cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒復(fù)制子包括：一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和兩個(gè)抗性基因Apr

、Tcr。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Cosmid載體的特點(diǎn)具有λ噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體的特性；具有較高容量的克隆能力；具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三節(jié)Cosmid載體二、Cosmid的構(gòu)建

Cosmid含有l(wèi)-DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒。由于l-DNA包裝時(shí)，其包裝蛋白只識(shí)別粘性末端附近的一小段順序，均1.5kb長。如果將這一小段DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個(gè)重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時(shí)它仍可象l-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與λ噬菌體DNA所不同的是，Cosmid不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞，它的制備與質(zhì)粒相同。進(jìn)入細(xì)胞后，通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第三節(jié)Cosmid載體三、Cosmid的優(yōu)越性1.能象l-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞2.可以裝載比質(zhì)?；騦-DNA大得多的外源DNA片段，如cos區(qū)及附近順序長為1.7kb，質(zhì)粒長為3.3kb，則該Cosmid最大可裝載45.9kb的外源DNA3.由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選4.由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新采用Cosmid作載體的困難①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13一、M13單鏈?zhǔn)删w的分子生物學(xué)M13是一種單鏈DNA噬菌體，總長6407bp，閉合環(huán)狀正鏈ssDNA。噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內(nèi)孔將DNA注入細(xì)菌體內(nèi)。

單鏈DNA利用宿主細(xì)胞的復(fù)制另一條鏈（負(fù)鏈），形成dsDNA（RFDNA），故M13能以dsDNA的形式從細(xì)胞中分離作為克隆載體宿主細(xì)胞不會(huì)發(fā)生裂解。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新M13單鏈DNA噬菌體的生命周期1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新RFDNA1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新M13載體

具有多克隆位點(diǎn)(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便。可以定向地克隆DNA片段，克隆在M13RFDNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時(shí)分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨(dú)立的克隆。根據(jù)M13的生物學(xué)特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（＋）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時(shí)的取向。這樣一來，為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個(gè)行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Blue-whiteselection1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Blue-whiteselection1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRI

BamHI

HindIII

PstI

BglI

BglI

PstI

HindIII

BamHI

EcoRI

BP

PBBP

BPBPBamHI&PstI1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途1、最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，單鏈DNA的用途：

用于雙脫氧末端終止測(cè)定DNA順序用于單鏈DNA的定點(diǎn)誘變

用于合成探針1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第四節(jié)單鏈DNA噬菌體M13二、M13-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)及用途2.篩選方便

感染的受體細(xì)胞生長緩慢，形成渾濁圈，易于挑選辨認(rèn)而且重組分子越大，渾濁圈的渾濁度亦越大，這樣可以直接辨認(rèn)哪些菌落含有外源DNA片段。1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新第五節(jié)其他載體一、BAC：細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome）

基于F因子建立起來的單拷貝E.coli載體，裝載容量300Kb，穩(wěn)定性較好，用于克隆大片端DNA，從而構(gòu)建整個(gè)人類基因組文庫1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新BAC載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新Structureofabacterialartificialchromosome(BAC),usedforcloninglargefragmentsofdonorDNA.CMRisaselectablemarkerforchloramphenicolresistance.oriS,repE,parA,andparBareFgenesforreplicationandregulationofcopynumber.cosNisthecossitefromlphage.HindIIIandBamHIarecloningsitesatwhichforeignDNAisinserted.Thetwopromotersarefortranscribingtheinsertedfragment.TheNotIsitesareusedforcuttingouttheinsertedfragment.1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新PAC載體1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等。動(dòng)物分子克隆載體

1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新（一）

構(gòu)建動(dòng)物克隆載體的病毒種類和特征

病毒類型例子病毒大小(nm)基因組結(jié)構(gòu)基因組大小(kb)細(xì)小病毒野生型H-1,RV,MVM20ss-DNA1.8-2.7

缺陷型AAV乳多空病毒乳實(shí)瘤兔,人(BPV)30-50環(huán)狀ds-DNA4.5-7.5

多型瘤小鼠腫瘤空泡SV40，BKV腺病毒人(AD)80-90ds-DNA30-40皰疹病毒

HSV,EBV100-150ds-DNA80-140痘病毒

300×200×100ds-DNA240-300逆病毒

MLV,MSV100-120ss-RNA8.51/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新（二）

病毒型載體

1.特點(diǎn)

1)

可在動(dòng)物細(xì)胞中形成病毒顆粒（形態(tài)構(gòu)成組分來自天然病毒或原病毒細(xì)胞）

2)

DNA轉(zhuǎn)移效率高，但必須與天然(輔助)病毒共感染動(dòng)物細(xì)胞

3)大多數(shù)被感染動(dòng)物細(xì)胞將是致死的，但有少數(shù)病毒（如逆病毒）載體可穩(wěn)定整合到染色體DNA中。

4)插入病毒載體的外源基因只能在動(dòng)物細(xì)胞中作瞬時(shí)表達(dá)

2.載體種類

根據(jù)構(gòu)建載體的病毒基因大小可分為兩類：1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新

1）復(fù)制型：由小分子病毒DNA構(gòu)建而成，具復(fù)制起點(diǎn)，其克隆位點(diǎn)可在病毒DNA之內(nèi)，亦可在病毒DNA之外，這類載體有的容量十分有限（如SV40），有的則很大（如HSV），其容量大小主要取決于病毒外殼蛋白的包裝能力。

2）非復(fù)制型：這類載體是在細(xì)菌克隆載體中插入一段病毒DNA（不含復(fù)制起點(diǎn)）。當(dāng)外源DNA插入該載體后，與相應(yīng)的天然病毒一起感染動(dòng)物細(xì)胞，外源DNA可借助兩病毒DNA同源部分的重組插入天然病毒。這類載體特別適合于那些較大的病毒DNA分子。

實(shí)例：痘病毒長180kb,編碼150多種多肽，整個(gè)生存階段均在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，它能合成DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾的各種酶類，由此病毒構(gòu)建的非復(fù)制型載體就是在細(xì)菌載體中插入一段痘病毒DNA.1/7/2025蘇州科技學(xué)院生物系葉亞新（三）質(zhì)粒型載體

1.特點(diǎn)：不能形成病毒顆粒，以高拷貝質(zhì)粒形式存在于動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，不導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞死亡。

2.組成：pMB1和病毒復(fù)制起點(diǎn)（如SV40，BPV，EBV等），適合于細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。

3.

實(shí)例

1)

SV40質(zhì)粒載體

SV40具如下物理圖譜，5243bp,為兩種抗原（T-和t-抗原）和三種病毒衣殼蛋白編碼。其中T-抗原參與SV40的有效感染，并能特異地結(jié)合在病毒DNA復(fù)制起點(diǎn)上，這種結(jié)合對(duì)DNA復(fù)制是必須的。因復(fù)制起點(diǎn)與該基因的啟動(dòng)子順序相近，故它本身的表達(dá)也受到T-抗原