程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老課件

2025/1/31第十三章程序性細(xì)胞死亡

與細(xì)胞衰老●程序性細(xì)胞死亡（programmmedcelldeath,PCD）●細(xì)胞衰老（cellageing或cellsenescence）2025/1/32程序性細(xì)胞死亡動(dòng)物細(xì)胞程序性死亡細(xì)胞凋亡（apoptosis）細(xì)胞壞死（necrosis）細(xì)胞自噬（autophagy）植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡植物細(xì)胞的程序性死亡：木質(zhì)部管狀細(xì)胞的成熟過(guò)程，植物細(xì)胞在受到真菌或細(xì)菌感染后會(huì)發(fā)生主動(dòng)快速死亡。死亡細(xì)胞的殘余被細(xì)胞壁固定在原位，被液泡中水解酶消化。酵母細(xì)胞的程序性死亡：與動(dòng)物程序性死亡類(lèi)似。2025/1/33細(xì)胞凋亡(Apoptosis)●細(xì)胞凋亡的概念和特征●細(xì)胞凋亡的生理意義：對(duì)于動(dòng)物個(gè)體的正常發(fā)育，自穩(wěn)態(tài)的維持，免疫耐受的形成，腫瘤監(jiān)控等多種生理及病理過(guò)程具有重要意義。蝌蚪尾的消失，發(fā)育過(guò)程中手和足的成形過(guò)程；脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育；凋亡不足導(dǎo)致腫瘤在內(nèi)的多種疾病，調(diào)亡過(guò)度導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的喪失?！窦?xì)胞凋亡的檢測(cè)方法●細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制2025/1/34細(xì)胞凋亡的概念和特征●細(xì)胞凋亡生物學(xué)意義：強(qiáng)調(diào)這種細(xì)胞的死亡方式是自然的生理學(xué)過(guò)程，是受基因調(diào)控的主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺行為?！駝?dòng)物細(xì)胞凋亡的過(guò)程，在形態(tài)學(xué)上分為三個(gè)階段：◆凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線(xiàn)粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布；

◆凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線(xiàn)粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個(gè)的凋亡小體；◆凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞或體內(nèi)的吞噬細(xì)胞所吞噬，凋亡細(xì)胞的殘余物質(zhì)被消化后重新利用。2025/1/35細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法◆形態(tài)學(xué)觀(guān)測(cè)：染色法（臺(tái)盼藍(lán)）、透射和掃描電鏡觀(guān)察。◆DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶。◆TUNEL測(cè)定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法?！翦缧请娪痉ǎ╟ometassay）：將細(xì)胞裂解處理，電泳并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞DNA降解片斷在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度快，使細(xì)胞核呈彗星式圖案?！袅魇郊?xì)胞分析：凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，呈亞二倍體狀態(tài)，用碘化丙腚染色使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光。

2025/1/36細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制●誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子●Caspase家族與凋亡

◆Caspase

◆Caspase依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡

▲死亡受體起始的外源途徑

▲線(xiàn)粒體起始的內(nèi)源途徑◆Caspase非依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡◆生死抉擇：細(xì)胞凋亡的調(diào)控2025/1/37誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線(xiàn)（紫外線(xiàn)，

射線(xiàn)等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等?！艋瘜W(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，鈣離子載體，維生素K3，視黃酸，細(xì)胞毒素，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，正常生理因子（激素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子等）失調(diào)以及腫瘤壞死因子

（TNF

）處理等。2025/1/38Caspase◆Caspase：是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱(chēng)為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶（Cysteineasparticacicspecificprotease），即Caspase。負(fù)責(zé)選擇性切割蛋白質(zhì)，使靶蛋白活化或失活?！艟€(xiàn)蟲(chóng)(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3，ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類(lèi)同源物是白介素-1β轉(zhuǎn)換酶（Interleukin-1β

convertingenzyme，ICE），被命名Caspase-1：◆哺乳動(dòng)物細(xì)胞Caspase家族成員有15種。◆細(xì)胞凋亡的分為激活期和執(zhí)行期兩個(gè)階段。2025/1/39細(xì)胞凋亡分為兩個(gè)階段激活期：前期細(xì)胞應(yīng)答死亡信號(hào)，起始Caspase活化。凋亡信號(hào)刺激→酶原分子在特異性的Asp位點(diǎn)被切割→形成兩個(gè)大小亞基的異二聚體→具有活性的Caspase；執(zhí)行期：后期執(zhí)行Caspase活化，執(zhí)行細(xì)胞死亡程序。起始Caspase招募執(zhí)行Caspase酶原分子后→進(jìn)行切割→產(chǎn)生具有活性的執(zhí)行Caspase→切割細(xì)胞內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)和功能蛋白→細(xì)胞凋亡。已知執(zhí)行Caspase底物約280種。起始Caspase和執(zhí)行Caspase組成細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的聯(lián)級(jí)分子網(wǎng)絡(luò)，凋亡程序一旦啟動(dòng)，網(wǎng)絡(luò)頂端起始Caspase首先活化，切割下游Caspase酶原，使得凋亡信號(hào)在短時(shí)間內(nèi)迅速放大并傳遞到整個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)。2025/1/310死亡受體起始的外源途徑▲凋亡信號(hào)通路：死亡配體主要是腫瘤壞死因子（TNF)家族成員，死亡配體的生物學(xué)功能是通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的，TNF-R1和Fas是死亡受體家族的代表成員，它們的胞質(zhì)部分均含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD），負(fù)責(zé)招募凋亡信號(hào)通路中的信號(hào)分子?！e例：配體與Fas結(jié)合→Fas聚合→Fas通過(guò)胞質(zhì)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域招募接頭蛋白FADD和Caspases-8酶原→形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物DISC→Caspases-8酶原在復(fù)合物中通過(guò)自身切割被激活→切割執(zhí)行者Caspases-3酶原→產(chǎn)生有活性的Caspases-3→導(dǎo)致細(xì)胞凋亡?；罨腃aspases-8酶還通過(guò)切割Bcl-2家族成員的Bid將凋亡信號(hào)傳遞到線(xiàn)粒體，引發(fā)內(nèi)源途徑，信號(hào)進(jìn)一步放大。2025/1/311線(xiàn)粒體起始的內(nèi)源途徑◆細(xì)胞受到內(nèi)部或外部的凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線(xiàn)粒體外膜的通透性會(huì)發(fā)生改變，向細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中釋放出凋亡相關(guān)因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡。哺乳動(dòng)物細(xì)胞接受凋亡信號(hào)刺激，CytC從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與另一個(gè)凋亡因子Apaf-1結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生?！艟€(xiàn)粒體外膜通透性改變主要受到Bcl-2蛋白家族的調(diào)控，是Ced-9在哺乳類(lèi)中的同源物，含有一個(gè)或多個(gè)BH結(jié)構(gòu)域，定位在線(xiàn)粒體外膜上，或接受信號(hào)后轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體外膜上。◆細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后促凋亡因子Bax和Bak發(fā)生寡聚化，從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體外膜上，與膜上陰離子通道蛋白作用，使通道開(kāi)放，線(xiàn)粒體內(nèi)凋亡因子（CytC）釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞凋亡?！鬊cl-2、線(xiàn)粒體與細(xì)胞凋亡2025/1/312Caspase非依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡◆凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）：是能夠誘導(dǎo)Caspase非依賴(lài)性細(xì)胞凋亡的因子，位于線(xiàn)粒體外膜，凋亡過(guò)程中，AIF從線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核，引起核內(nèi)DNA凝集并斷裂成50kp大小的片段?！粝拗菩?xún)?nèi)切酶G（EndoG）：屬于Mg2+依賴(lài)性的核酸酶家族，定位于線(xiàn)粒體，主要功能負(fù)責(zé)線(xiàn)粒體DNA的修復(fù)和復(fù)制。受到凋亡信號(hào)的刺激后，EndoG從線(xiàn)粒體釋放出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)DNA進(jìn)行切割。在Caspase未被激活的情況下，產(chǎn)生典型的以核小體為單位的DNA片段。2025/1/313生死抉擇：細(xì)胞凋亡的調(diào)控Caspase抑制因子：直接與Caspase活性分子結(jié)合，阻抑其對(duì)底物的切割作用，包括c-IAP家族7個(gè)成員，c-FLIP，BAR和ARC；所有IAP家族成員都具有70個(gè)氨基酸殘基組成的BIR結(jié)構(gòu)域，對(duì)抑制凋亡是必需的。IAP家族成員的抗凋亡作用也能被特異的抑制因子解除，當(dāng)?shù)蛲龀绦騿?dòng)后，有兩種蛋白Smac/DIABLO和Omi/HtrA2與CytC一起從線(xiàn)粒體中釋放，兩種蛋白含有IAP結(jié)合基序，與IAP結(jié)合并釋放出被IAP封閉的Caspase。內(nèi)源性Caspase抑制因子2025/1/314名稱(chēng)抑制底物NAIP(BIRC1)Caspase-3,-7c-IAP1

(BIRC2)Caspase-3,-7c-IAP2(BIRC3)Caspase-3,-7XIAP(BIRC4)Caspase-3,-7,-9Survivin(BIRC5)Caspase-3,-7Livin(BIRC7)Caspase-3,-7,-9ILP-2(BIRC8)Caspase-9c-FLIP(I-FLICE)Caspase-8,-10ARCCaspase-2,-8BARCaspase-82025/1/315細(xì)胞壞死（necrosis）2025/1/316細(xì)胞自噬（autophagy）◆正常的動(dòng)物細(xì)胞為了維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的動(dòng)態(tài)平衡，需要不斷地降解功能失常的或不需要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如各種蛋白質(zhì)、細(xì)胞器以及各種細(xì)胞組分：

▲壽命短的蛋白質(zhì)通過(guò)泛素-蛋白酶體系降解；

▲壽命較長(zhǎng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)通過(guò)細(xì)胞自噬途徑?！艏?xì)胞自噬參與了細(xì)胞死亡的過(guò)程，是與細(xì)胞凋亡不同的另一種程序性死亡方式。線(xiàn)蟲(chóng)幼蟲(chóng)在營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)會(huì)通過(guò)細(xì)胞自噬降解自身的部分細(xì)胞維持個(gè)體存活。細(xì)胞自噬不需要吞噬細(xì)胞就能自我銷(xiāo)毀，可能是細(xì)胞凋亡的補(bǔ)充途徑。2025/1/317細(xì)胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●細(xì)胞衰老的概念及特征●細(xì)胞衰老的分子機(jī)制●細(xì)胞衰老與個(gè)體衰老和癌癥的關(guān)系2025/1/318細(xì)胞衰老的概念及特征●概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀(guān)點(diǎn)。細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無(wú)限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限●細(xì)胞衰老過(guò)程形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的變化◆細(xì)胞核的變化：體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，細(xì)胞核隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加不斷增大，細(xì)胞核的核膜內(nèi)折（invagination）、染色質(zhì)固縮化。

◆內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化：衰老動(dòng)物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量減少了?！艟€(xiàn)粒體的變化：細(xì)胞中線(xiàn)粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大?！糁旅荏w的生成：衰老的動(dòng)物細(xì)胞致密體積累，由溶酶體或線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)化而來(lái)?！裟は到y(tǒng)的變化：衰老的細(xì)胞，其膜的流動(dòng)性降低、韌性減小，衰老細(xì)胞間隙連接減少。2025/1/319細(xì)胞來(lái)源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來(lái)源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)2025/1/320細(xì)胞衰老的分子機(jī)制●復(fù)制衰老的機(jī)制：端粒酶的發(fā)現(xiàn)證實(shí)端粒長(zhǎng)度與衰老有著密切的關(guān)系，端粒被認(rèn)為是細(xì)胞的“分子時(shí)鐘”。pRb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F家族結(jié)合阻抑其活性，E2F負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄G1/S期轉(zhuǎn)換以及DNA復(fù)制過(guò)程中的基因，E2F被pRb封閉；CDK磷酸化pRb細(xì)胞可進(jìn)入S期；如果CDK活化被抑制，細(xì)胞停留在G1期，阻斷細(xì)胞周期正常運(yùn)行，引發(fā)復(fù)制型細(xì)胞衰老。CDK抑制因子（p16和p21）引起衰老。

●脅迫誘導(dǎo)的早熟性衰老：代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（ROS---O2-，OH-，H2O2），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老?！駟渭?xì)胞與衰老:酵母染色體外環(huán)型rDNA（ERC）的積累，ERC集中在母細(xì)胞，不進(jìn)入子細(xì)胞，導(dǎo)致母細(xì)胞ERC積累而衰老。2025/1/3212025/1/3222025/1/3232025/1/324細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker

（自趙允、翟中和）2025/1/3252025/1/326

a正常T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞b凋亡細(xì)胞(掃描電鏡)c凋亡細(xì)胞(透射電鏡)2025/1/327caspase超家族成員及其在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的功能2025/1/328