DB45T 2205-2020 甘蔗及其制品中葡聚糖的測定方法免疫比濁法

ICS67.180CCSX30DB45廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB45/T2205—2020本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由廣西壯族自治區(qū)糖業(yè)發(fā)展辦公室提出并宣貫。本文件由廣西糖業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：廣西糖業(yè)集團有限公司、廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所）、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院、廣西糖業(yè)集團防城精制糖有限公司。本文件主要起草人：柳穎、林榮珍、常國煒、馬步、鄧衛(wèi)利、楊宇格、劉桂云、繆路、黎志德、張九花、楊華、林金梅、方海香、梁達(dá)奉。1DB45/T2205—2020甘蔗及其制品中葡聚糖的測定方法免疫比濁法本文件規(guī)定了甘蔗及其制品中葡聚糖含量免疫比濁法的測定。本文件適用于廣西境內(nèi)甘蔗及其制品中葡聚糖含量為3.5mg/L～600mg/L的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T9289制糖工業(yè)術(shù)語3術(shù)語和定義GB/T9289界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1葡聚糖dextran又稱右旋糖酐，是蔗糖經(jīng)明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)轉(zhuǎn)化形成的，一種完全由α-D-吡喃葡萄糖單體構(gòu)成的多糖，分子式[C6H10O5]n，分子量通常為數(shù)萬至數(shù)百萬。4原理利用葡聚糖與葡聚糖單克隆抗體特異性反應(yīng)，形成葡聚糖-葡聚糖單克隆抗體復(fù)合物析出，使反應(yīng)體系濁度增加，濁度增量和葡聚糖含量成正比，通過增量濁度與標(biāo)準(zhǔn)系列來比較定量。5試劑5.1除非另有說明，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.2鹽酸（HCl）溶液（1+99）：量取1mL鹽酸，加入99mL水，混勻。5.3緩沖溶液：稱取0.800g氯化鈉（NaCl）、0.020g氯化鉀（KCl）、0.363g十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）和0.024g磷酸二氫鉀（KH2PO4溶于90mL水中，以鹽酸溶液（1+99）調(diào)pH至7.2，移入100mL容量瓶，定容。5.4蔗糖儲備液（250g/L）：稱取25.0g蔗糖（C12H22O11，優(yōu)級純，且葡聚糖含量低于5mg/kg），用水溶解，移入100mL容量瓶，定容。5.5葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品:CAS號：9004-54-0，純度>99％。2DB45/T2205—20205.6葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1mg/mL）：稱取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品2g（準(zhǔn)確至0.1mg）于已恒重的稱量瓶內(nèi)，放于干燥箱內(nèi)在105℃下干燥3h，取出，放在干燥器內(nèi)，冷卻至室溫，稱量（準(zhǔn)確至0.1mg計算葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品中的水分含量。根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的水分含量，迅速稱取未經(jīng)干燥的葡聚糖，使其含無水葡聚糖約0.1000g，加入2.0mL水溶解成糊狀，放置約10min，不時攪拌，使粒子均勻水化，當(dāng)有凝膠物存在時，多次加入少量水至約25mL將凝膠狀物溶解，移入100mL容量瓶，定容。此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。5.7葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1mg/mL）0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于10mL容量瓶，再分別吸取蔗糖儲備液（250g/L）6mL于上述6個10mL容量瓶中，定容。此葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度分別為0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L和100mg/L?？筛鶕?jù)樣品中葡聚糖的實際含量配制相應(yīng)質(zhì)量濃度的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，質(zhì)量濃度不超過600mg/L。5.8葡聚糖單克隆抗體溶液：稱取0.060g葡聚糖單克隆抗體（鼠抗葡聚糖IgM，效價大于106），溶于15mL緩沖溶液中，靜置30min，移入帶蓋棕色小瓶，蓋好，備用。該溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，在4℃下貯存期為7d。6儀器和設(shè)備6.1濁度儀：配1cm四面透光測試皿；入射光波長λ：(860±30)nm（LED光源）或400nm～600nm（鎢燈），檢測器處在與入射光垂直的位置上。6.2分析天平：感量為0.1mg。6.3干燥箱：控溫范圍室溫為+5℃至250℃,溫度分辨率為0.1℃。6.4移液器：量程為20μL。6.5濾膜：水系，厚薄均勻，膜面上分布著對稱、均勻、穿透性強的微孔，孔徑為0.22μm。6.6秒表：精度為1s。7測定步驟7.1試樣制備初壓汁、混合汁、中和汁、清汁等錘度小于25°Bx的液態(tài)樣品，用濾網(wǎng)或濾布過濾，再以水系濾膜過濾備用；糖漿、糖膏、糖糊等錘度大于或等于25°Bx的液態(tài)樣品和固態(tài)樣品，稱取15.0g～20.0g樣品（m用水稀釋或溶解，移入100mL容量瓶，定容，以水系濾膜過濾備用。7.2測定方法7.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用2mL吸量管吸取1.5mL葡聚糖單抗溶液置于測試皿，放入濁度儀，蓋上濁度儀蓋子，放置1min后立即測定濁度值（N標(biāo)0）；取出測試皿，用移液器將15μL葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)系列溶液加入葡聚糖單抗溶液中，開啟秒表計時，蓋上測試皿蓋子，上下顛倒6次混勻，混勻過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，取下測試皿蓋子，將測試皿放入濁度儀，蓋上濁度儀蓋子，放置1min后立即測定濁度值（N標(biāo)應(yīng)在2min內(nèi)測定完畢，按8.1.1計算反應(yīng)溶液體系濁度增量(△NTU標(biāo)）。以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，濁度增量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.2.2試樣中葡聚糖濃度測定吸取1.5mL葡聚糖單抗溶液置于測試皿，放入濁度儀，蓋上濁度儀蓋子，放置1min后立即測定濁度值（N樣0）；取出測試皿，用移液器將15μL試樣溶液加入葡聚糖單抗溶液中，開啟秒表計時。蓋上測試3DB45/T2205—2020皿蓋子，上下顛倒6次混勻，混勻過程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。取下測試皿蓋子，將測試皿放入濁度儀，蓋上濁度儀蓋子，放置1min后立即測定濁度值（N樣應(yīng)在2min內(nèi)測定完畢，按8.1.2計算反應(yīng)體系濁度增量(△NTU樣），與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，得到試樣中葡聚糖濃度（c）。8計算及結(jié)果表示8.1濁度增量8.1.1標(biāo)準(zhǔn)品測定反應(yīng)溶液體系的濁度增量按式（1）計算：標(biāo)?標(biāo)?....................................................................（1）式中：??標(biāo)——測定標(biāo)準(zhǔn)品時反應(yīng)溶液體系的濁度增量，單位為散射濁度單位（NTU標(biāo)——測定標(biāo)準(zhǔn)品時反應(yīng)后體系濁度，單位為散射濁度單位（NTU）；標(biāo)?——測定標(biāo)準(zhǔn)品時反應(yīng)前體系濁度，單位為散射濁度單位（NTU）。計算結(jié)果表示到小數(shù)點后一位。8.1.2試樣測定反應(yīng)溶液體系的濁度增量按式（2）計算：樣?樣?....................................................................（2）式中：??樣——測定樣品時反應(yīng)溶液體系的濁度增量，單位為散射濁度單位（NTU樣——測定樣品時反應(yīng)后體系濁度，單位為散射濁度單位（NTU）；樣?——測定樣品時反應(yīng)前體系濁度，單位為散射濁度單位（NTU）。計算結(jié)果表示到小數(shù)點后一位。8.2樣品中葡聚糖含量低錘度液態(tài)樣品：將濁度增量代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品中葡聚糖含量，單位為毫克每升（mg/L計算結(jié)果取整數(shù)。高錘度液態(tài)樣品及固態(tài)樣品按式（3）計算：.............................................................................（3）式中：——樣品中葡聚糖含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的葡聚糖濃度，單位為毫克每升（mg/L——樣品稱樣量，單位為克（g）；100——樣品定容體積，單位為毫升（mL）。計算結(jié)果取整數(shù)。4DB45/T2205—20209精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不大于算數(shù)平均值的15