高考生物一輪復(fù)習(xí)第十單元第48課基因工程的基本工具和操作程序課件

第48課基因工程的基本工具和操作程序第十單元生物技術(shù)與工程·學(xué)業(yè)質(zhì)量水平要求·1.概述基因工程是在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。2.闡明DNA重組技術(shù)的實(shí)現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)、鑒定等步驟?？键c(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具1．基因工程的概念(1)手段：按照____________，通過________等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性。(2)目的：創(chuàng)造出更符合人們需要的新的__________和__________。(3)水平：____________水平。(4)基礎(chǔ)：__________、分子生物學(xué)和__________等學(xué)科。人們的愿望轉(zhuǎn)基因生物類型生物產(chǎn)品DNA分子生物化學(xué)微生物學(xué)2．基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”核苷酸序列磷酸二酯鍵黏性末端(2)DNA連接酶——“分子縫合針”①作用：將限制酶切割下來的DNA片段______________________，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)脫氧核苷酸之間的____________。

②類型常用類型E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源__________T4噬菌體特點(diǎn)只縫合__________縫合__________________拼接成新的DNA分子磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端和平末端(3)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”①作用：將__________送入受體細(xì)胞中。②種類：質(zhì)粒、噬菌體和____________等。③條件a．具有一個(gè)至多個(gè)________________，供外源DNA插入其中。b．能在受體細(xì)胞中進(jìn)行__________，或整合到受體DNA上，隨受體DNA__________。c．具有__________，便于重組DNA分子的篩選。外源基因動(dòng)植物病毒限制酶切割位點(diǎn)自我復(fù)制同步復(fù)制標(biāo)記基因3．DNA的粗提取與鑒定(1)實(shí)驗(yàn)原理DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)腳___________方法對(duì)它們進(jìn)行提取。①DNA不溶于______。②DNA在不同濃度的____________中溶解度不同，它能溶于___________的NaCl溶液。③在一定溫度下，DNA遇________試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色。物理或化學(xué)酒精NaCl溶液2mol/L二苯胺(2)實(shí)驗(yàn)步驟1．DNA連接酶能將兩堿基間的氫鍵連接起來。(

)2．E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。(

)3．限制酶也可以識(shí)別和切割RNA。(

)4．質(zhì)粒是小型環(huán)狀DNA分子，是基因工程中常用的載體。(

)5．外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動(dòng)子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制。(

)6．切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列。(

)7．DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事。(

)×××√×××1．(選擇性必修3P71旁欄思考改編)限制酶來源于原核生物，不能切割自己的DNA分子的原因是_____________________________________________________

_________。2．(選擇性必修3P72旁欄思考改編)DNA連接酶和DNA聚合酶的作用區(qū)別是

_______________________________________________________________________________________________。原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，而DNA聚合酶是將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈的末端考向1|

基因工程中工具酶的應(yīng)用1．(2024·江蘇淮安統(tǒng)考)基因工程中需使用多種工具酶，幾種限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列說法正確的是(

)A．限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的末端，可以通過E.coliDNA連接酶相互連接B．DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成C．限制酶EcoRⅠ進(jìn)行一次切割，會(huì)切斷2個(gè)磷酸二酯鍵，形成1個(gè)游離的5′-末端D．若兩種限制酶的識(shí)別序列相同，則形成的末端一定能通過DNA連接酶相互連接√B

解析：限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端，而T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，但連接平末端的效率較低，A錯(cuò)誤。DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵；DNA聚合酶將單個(gè)脫氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵；RNA聚合酶將單個(gè)核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯鍵，B正確。一個(gè)限制酶切割一次，使DNA雙鏈斷開，會(huì)有2個(gè)磷酸二酯鍵斷裂，形成2個(gè)游離的5′-末端，C錯(cuò)誤。若兩種限制酶的識(shí)別序列相同，但由于識(shí)別的位點(diǎn)不同，切割形成的末端不同，則不能通過DNA連接酶相互連接，D錯(cuò)誤。與DNA有關(guān)的酶的比較名稱作用部位作用底物作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵DNA將鏈狀DNA切成兩個(gè)片段，將環(huán)狀DNA切成一個(gè)片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸解旋酶堿基對(duì)之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長(zhǎng)鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸將單個(gè)核糖核苷酸依次連接到RNA單鏈末端2．(2024·重慶聯(lián)考)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是(

)A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接√C

解析：酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A錯(cuò)誤；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C正確；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D錯(cuò)誤。限制酶的選擇

(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類①應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn))。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端。②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)。如圖乙中限制酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因。考向2|

基因工程中載體的應(yīng)用3．作為基因工程的運(yùn)輸工具——運(yùn)載體，必須具備的條件及理由是(

)A．具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)B．具有某些標(biāo)記基因，以使目的基因能夠與其結(jié)合C．能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便目的基因能夠穩(wěn)定的存在和擴(kuò)大數(shù)量D．對(duì)宿主細(xì)胞無傷害，以便于重組DNA的鑒定和選擇√C

解析：質(zhì)粒等運(yùn)載體應(yīng)具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的插入，A錯(cuò)誤；質(zhì)粒等運(yùn)載體應(yīng)具有某些標(biāo)記基因，以便篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒等運(yùn)載體應(yīng)能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便目的基因能夠穩(wěn)定的存在和擴(kuò)大數(shù)量，C正確；質(zhì)粒等運(yùn)載體必須具有某些標(biāo)記基因，以便于重組DNA的鑒定和選擇，D錯(cuò)誤。4．(2024·陜西渭南模擬)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，它存在于許多細(xì)菌體內(nèi)。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因如圖所示，通過標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不同，右圖表示外源基因插入位置(插入點(diǎn)有a、b、c)，請(qǐng)根據(jù)表中提供細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，推測(cè)①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)，正確的一組是(

)

A．①是c；②是b；③是a

B．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是a

D．①是c；②是a；③是b分類細(xì)菌在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況細(xì)菌在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況①能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)②能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)③不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)√A

解析：第①組：細(xì)胞能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明抗氨芐青霉素基因沒有被破壞；細(xì)菌能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，說明抗四環(huán)素基因沒有被破壞，由此可知，外源基因插入的位置不是a、b，而是c。第②組：細(xì)胞能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明抗氨芐青霉素基因沒有被破壞；細(xì)菌不能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明抗四環(huán)素基因被破壞，由此可知，外源基因插入位置是b。第③組：細(xì)胞不能在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說明抗氨芐青霉素基因被破壞，抗四環(huán)素基因沒有被破壞，由此可知，外源基因插入的位置是a。故選A。分類細(xì)菌在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況細(xì)菌在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況①能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)②能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)③不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)細(xì)胞膜上的載體(蛋白)與基因工程中的載體的兩個(gè)“不同”(1)化學(xué)本質(zhì)不同①細(xì)胞膜上的載體的化學(xué)成分是蛋白質(zhì)。②基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如質(zhì)粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌體、動(dòng)植物病毒等。(2)功能不同①細(xì)胞膜上的載體的功能是協(xié)助細(xì)胞膜控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。②基因工程中的載體是一種“分子運(yùn)輸車”，把目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?？枷?|

DNA的粗提取與鑒定5．(2023·廣東卷)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C．沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色√D

解析：裂解是加蒸餾水讓細(xì)胞吸水漲破，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，其能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以反復(fù)多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA純度，C正確；將DNA溶解于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑后沸水浴5min，待冷卻后，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，D錯(cuò)誤。6．下圖為雞血細(xì)胞中DNA的粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)過程中的部分操作示意圖，請(qǐng)據(jù)圖分析，下列相關(guān)敘述中，正確的是(

)A．該實(shí)驗(yàn)的正確操作順序是③→①→②→④→⑤B．用同樣方法從等體積豬血和雞血中提取的DNA量相近C．⑤表示要鑒定步驟①中所得到的白色絲狀物主要成分為DNA，可使用二苯胺試劑來鑒定，沸水浴冷卻后，出現(xiàn)藍(lán)色的試管組別是對(duì)照組D．步驟①的目的是初步分離DNA與蛋白質(zhì)，析出并獲得DNA；步驟④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度較大√D

解析：DNA的粗提取和鑒定步驟是加入蒸餾水，破碎細(xì)胞→過濾，獲取含DNA的濾液→去除濾液中雜質(zhì)→DNA的析出→鑒定，因此題圖中正確的實(shí)驗(yàn)操作順序是③→②→①→④→⑤，A錯(cuò)誤；豬血成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核，提取不到DNA，用同樣方法從等體積豬血和雞血中提取的DNA量不相同，B錯(cuò)誤；⑤表示要鑒定步驟①中所得到的白色絲狀物主要成分為DNA，可使用二苯胺試劑來鑒定，沸水浴冷卻后，出現(xiàn)藍(lán)色的試管組別是實(shí)驗(yàn)組，出現(xiàn)藍(lán)色則證明該絲狀物的主要成分是DNA，C錯(cuò)誤；步驟①的目的是析出并獲得DNA，步驟④中在2mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度較大，D正確?？键c(diǎn)二基因工程的基本操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞______或獲得預(yù)期__________等的基因。性狀表達(dá)產(chǎn)物(2)篩選合適的目的基因①?gòu)南嚓P(guān)的已知____________清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用___________和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣蒧_________。②常用______特異性地快速擴(kuò)增目的基因。③構(gòu)建__________獲取目的基因結(jié)構(gòu)和功能序列數(shù)據(jù)庫(kù)目的基因PCR基因文庫(kù)過程說明圖解變性溫度超過_______時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈

復(fù)性溫度下降到_______左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合

延伸溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的______________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈

(4)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因①原理：____________。②條件：DNA模板、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸。③擴(kuò)增過程90℃50℃DNA聚合酶DNA復(fù)制④PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的比較⑤PCR中引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意的問題a．設(shè)計(jì)引物的依據(jù)：目的基因兩端的核苷酸序列。b．引物設(shè)計(jì)時(shí)既要考慮目的基因序列，又要考慮載體序列，原因：為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的5′-端加上限制酶的酶切位點(diǎn)。c．使用的一對(duì)引物的序列不相同，因?yàn)槟康幕騼啥司哂胁煌暮塑账嵝蛄小．引物設(shè)計(jì)的要求(或引物失效的原因)：每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)；兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。e．每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)的原因：防止引物自身折疊。f．兩種引物之間不能在局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的原因：防止引物之間配對(duì)，導(dǎo)致引物不能同模板鏈結(jié)合。g．兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的3′-端；脫氧核苷酸連接在引物的3′-端進(jìn)行延伸。2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因___________________________________________，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(2)基因表達(dá)載體的組成及作用RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(1)轉(zhuǎn)化的含義：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。(2)轉(zhuǎn)化的方法類型常用方法常用受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法體細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的_________中→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→侵染植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)動(dòng)物顯微注射法________將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→胚胎移植→獲得具有新性狀的動(dòng)物微生物Ca2+轉(zhuǎn)化法原核細(xì)胞Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài))→重組表達(dá)載體(DNA分子)與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子T-DNA受精卵(3)篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞①原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時(shí)，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會(huì)導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如上圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。②被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌。③篩選方法：將細(xì)菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)粒的細(xì)菌，如上圖1、2、3、4、5菌落。再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如上圖能生長(zhǎng)的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的即為含有目的基因的菌落，如上圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。4．目的基因的檢測(cè)與鑒定(1)分子水平檢測(cè)(2)個(gè)體水平鑒定例如：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。檢測(cè)方法檢測(cè)目的判斷標(biāo)準(zhǔn)_________和電泳鑒定目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否出現(xiàn)相應(yīng)的電泳條帶或是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA________________技術(shù)目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)是否出現(xiàn)雜交帶PCR擴(kuò)增抗原—抗體雜交5．DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)實(shí)驗(yàn)原理①PCR原理：利用了_____________原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。②電泳：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷______的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的____________等有關(guān)。DNA的熱變性相反大小和構(gòu)象(2)實(shí)驗(yàn)步驟離心管(3)DNA的電泳鑒定(4)成功擴(kuò)增出DNA片段的判斷依據(jù)是可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶。微量移液器紫外燈1．基因表達(dá)載體中含有啟動(dòng)子和密碼子。(

)2．檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)可用抗原—抗體雜交技術(shù)。(

)3．將重組表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物受精卵常用基因槍法。(

)4．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)需要設(shè)計(jì)兩種引物。(

)5．用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不必知道基因的全部序列。(

)6．抗蟲基因即使成功地插入植物細(xì)胞染色體DNA上也未必能正常表達(dá)。(

)7．從大腸桿菌細(xì)胞中獲得了人胰島素基因的mRNA，說明目的基因完成了表達(dá)。(

)×√×√√√×1．(選擇性必修3P78圖3-5延伸)自然界中的DNA復(fù)制和PCR都需要引物的原因是___________________________________________________________________

___________________________________。2．(選擇性必修3P79旁欄思考)用PCR不可以擴(kuò)增mRNA的原因是____________

________________________________________________________________________________________。在DNA合成時(shí)，DNA聚合酶只能從已有的脫氧核苷酸鏈的3′-端開始連接脫氧PCR是用DNA核苷酸，從5′-端到3′-端延伸子鏈雙鏈做模板，不能直接用單鏈RNA進(jìn)行PCR，必須把mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA之后再進(jìn)行PCR考向1|

PCR技術(shù)與應(yīng)用分析1．(2024·黑龍江大慶統(tǒng)考)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似，過程如圖所示。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)A．引物A、B的堿基不能進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)B．復(fù)性的目的是讓引物與單鏈DNA相結(jié)合C．延伸時(shí)，DNA聚合酶從引物的3′-端連接脫氧核苷酸D．第二輪循環(huán)后，同時(shí)含有引物A、B的DNA占100%√D

解析：如果引物A和引物B發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)則不能與相應(yīng)模板鏈結(jié)合，無法完成子鏈的延伸，故引物A、B的堿基不能進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，A正確；復(fù)性的目的是讓引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合，B正確；延伸時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，將4種脫氧核苷酸加到引物的3′-端，C正確；DNA復(fù)制為半保留復(fù)制，第二輪循環(huán)即DNA復(fù)制2次，共形成22＝4個(gè)DNA分子，其中含有最初模板鏈的2個(gè)DNA分子含有引物A或引物B，其余2個(gè)DNA分子均含有引物A和引物B，所以第二輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段占50%，D錯(cuò)誤。2．下圖表示PCR過程中某個(gè)階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是(

)

A．②鏈從L到R的方向?yàn)?′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制C．以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個(gè)引物③D．物質(zhì)③的5′-端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物√D

解析：根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系可判斷，②鏈從L到R的方向?yàn)?′→3′，題圖中①②鏈均可作為子鏈合成的模板，A錯(cuò)誤；PCR過程需要通過高溫處理使雙鏈中氫鍵斷裂成為單鏈，再通過降溫使子鏈和引物之間形成雙鏈結(jié)構(gòu)，而后調(diào)節(jié)溫度使子鏈沿著引物的3′-端延伸，B錯(cuò)誤；以1個(gè)DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23＝8個(gè)，則需消耗引物③的數(shù)目為(8×2－2)÷2＝7個(gè)，C錯(cuò)誤；物質(zhì)③的5′-端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得以該序列為模板合成的雙鏈DNA產(chǎn)物，D正確。PCR過程的兩點(diǎn)提醒(1)復(fù)性不一定均為引物與DNA模板結(jié)合。復(fù)性時(shí)，引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在DNA解開的兩條鏈的結(jié)合。(2)PCR反應(yīng)的結(jié)果不都是所需的DNA片段。因?yàn)榈谝淮窝h(huán)得到的DNA片段只有一種引物，比所需的DNA片段要長(zhǎng)，從第三次循環(huán)才出現(xiàn)所需的DNA片段，這樣的片段存在兩種引物?？枷?|

目的基因的獲取及表達(dá)載體的構(gòu)建3．(2023·廣東卷)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對(duì)野生型擬南芥(2n＝10)進(jìn)行誘變，篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個(gè)堿基G到A的替換，突變后的基因?yàn)殡[性基因，據(jù)此推測(cè)突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。回答下列問題：(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變?cè)斐?，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與________植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)PCR產(chǎn)物和______進(jìn)行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備________________。野生型載體啟動(dòng)子和終止子(3)轉(zhuǎn)化后，T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時(shí)不發(fā)生交換)可在基因組單一位點(diǎn)插入也可以同時(shí)插入多個(gè)位點(diǎn)。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點(diǎn)插入的植株，并進(jìn)一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如圖甲)，用于后續(xù)驗(yàn)證突變基因與表型的關(guān)系。

①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T1代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長(zhǎng)的陽性個(gè)體即表示其基因組中插入了______________________________。②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約____%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。DAI基因和卡那霉素抗性基因75③將②中選出的T2代陽性植株______(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達(dá)到_____%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測(cè)該突變，研究者利用PCR擴(kuò)增野生型和突變型基因片段，再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物。通過核酸電泳即可進(jìn)行突變檢測(cè)，相關(guān)信息如圖乙，在電泳圖中將酶切結(jié)果對(duì)應(yīng)位置的條帶涂黑。自交100解析：(1)突變后的基因?yàn)殡[性基因，所以將DAI基因?qū)胪蛔凅w植株后，若突變體表型確由該突變?cè)斐桑瑒t轉(zhuǎn)基因植株的種子大小與野生型植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴(kuò)增DAI基因，用同種限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行切割、用DNA連接酶將兩者連接；為確保插入的DAI基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具備啟動(dòng)子和終止子。(3)①因?yàn)檫x擇的是單一位點(diǎn)插入的植株，所以能在卡那霉素選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的陽性個(gè)體的基因組中插入了卡那霉素抗性基因和DAI基因。②假設(shè)控制種子大小這一性狀的基因用A/a表示，T1代陽性植株是單一位點(diǎn)插入的植株，類似于顯性雜合子(Aa)，所以自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，應(yīng)該選擇基因型為A_的植株，即選擇陽性率為75%的培養(yǎng)基中幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③步驟②中選出的T2代陽性植株中既有純合子(AA)又有雜合子(Aa)，所以需要進(jìn)行自交，所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達(dá)到100%的培養(yǎng)基中的幼苗即為純合子，是目標(biāo)轉(zhuǎn)基因植株。由圖乙可知，限制性內(nèi)切核酸酶X可以將突變基因切割為50bp和100bp兩個(gè)片段，而野生型基因無限制酶X的切割位點(diǎn)，故電泳圖具體酶切結(jié)果見答案。(1)基因工程中的基因表達(dá)載體≠載體：基因表達(dá)載體與載體相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子和終止子之間的部位，若目的基因插入啟動(dòng)子部位，啟動(dòng)子將失去原功能。(3)切割目的基因和載體并非只能用同一種限制酶。如果兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來。考向3|

將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞及目的基因的檢測(cè)與鑒定4．(2024·遼寧沈陽模擬)生長(zhǎng)素參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍?PINI)對(duì)IAA的極性運(yùn)輸具有重要作用。為研究35S啟動(dòng)子(一種來自病毒的強(qiáng)啟動(dòng)子)能否引起下游基因的過量表達(dá)，研究人員將35S啟動(dòng)子與PINI基因轉(zhuǎn)入擬南芥，觀察PINI過量表達(dá)對(duì)植物的影響。(1)獲取PINI基因的mRNA后，通過RT-PCR擴(kuò)增獲取PINI基因(DNA)時(shí)所需要的酶是_______________________。每次PCR循環(huán)分為3步，其中所需溫度最低的一步稱為______。(2)PINI基因不能直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，需要構(gòu)建PINI表達(dá)載體。構(gòu)建PINI表達(dá)載體的目的是________________________________________________________________

__________________________________。利于PINI基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；利于PINI基逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶復(fù)性因在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用(3)為將PINI基因以正確方向插入質(zhì)粒需要雙酶切。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，需在引物的5′-端加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。已知PINI基因的1鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，據(jù)下圖分析，引物1和引物2的酶切位點(diǎn)分別為_____________________________，理由是_____________________________________