基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)

PrinciplesAndExperimentalTechnicsinGeneEngineering基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)教材和參考書教材：簡明基因工程與應(yīng)用吳建平主編，2005，科學(xué)出版社主要參考書：1.基因工程張惠展編著,華東理工大學(xué)出版社,20052.基因工程孫明主編,高等教育出版社,20063.基因工程原理吳乃虎編著，科學(xué)出版社,(第二版),19984.基因工程

彭銀祥,主編,20075.基因工程技術(shù)鐘衛(wèi)鴻主編,化學(xué)工業(yè)出版社,2007基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一章基因工程的概論第一節(jié)基因工程的概念

一、基因工程的基本概念

狹義基因工程

廣義基因工程基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)狹義基因工程

狹義的基因工程(geneengineering):

從狹義上講，基因工程是指將一種或多種生物體(供體)的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另—種生物體(受體)內(nèi)．使之按照人們的意愿遺傳并表達(dá)出新的性狀。因此，供體、受休、載體稱為基因工程的三大要素?；蚬こ淘砑皩?shí)驗(yàn)技術(shù)狹義基因工程

狹義的基因工程:就是重組DNA技術(shù)（recombinantDNAtechniques）1）重組DNA技術(shù)

（recombinantDNAtechniques)2）分子克?。╩olecularcloning)3）基因克隆（genecloning)4）遺傳操作(geneticmanipulation）5）遺傳工程(geneticengineering)6）基因工程(geneengineering)基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)廣義基因工程廣義的基因工程：是指DNA重組技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是外源基因重組、克隆、表達(dá)的設(shè)計與構(gòu)建(即狹義的基因工程)；下游技術(shù)則涉及含有重組外源基因的生物細(xì)胞(基因工程菌或細(xì)胞)的大規(guī)模培養(yǎng)以及外源基因的表達(dá)、產(chǎn)物的分離、純化過程。因此，廣義的基因工程概念更傾向于工程學(xué)的范疇。

基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)廣義的基因工程是一個高度統(tǒng)一的整體。上游DNA重組的設(shè)計必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導(dǎo)思想。而下游過程則是上游基因重組藍(lán)圖的體現(xiàn)與保證。這是基因工程產(chǎn)業(yè)化的基本原則?；蚬こ淘砑皩?shí)驗(yàn)技術(shù)狹義的基因工程

重組DNA技術(shù)

廣義的基因工程

重組DNA技術(shù)細(xì)胞工程染色體工程細(xì)胞器工程基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)二、基因工程的基本過程

基因工程:兩大部分組成

基因工程的整個過程由工程菌(細(xì)胞)的設(shè)計構(gòu)建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成

工程菌(細(xì)胞)的設(shè)計構(gòu)建:實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行，其單元操作過程如下:(1)從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA(包括外源基因或目的基因)和載體分子切開(簡稱“切”)；基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)

(2)用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上形成DNA重組分子(簡稱“接”)；

(3)借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中(簡稱“轉(zhuǎn)”)；(4)短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞、以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中(簡稱“增”)；(5)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞(簡稱“檢”)；基因工程的上游操作過程；可簡化為：切、接、轉(zhuǎn)、增、檢。

基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)三．基因工程的基本原理

基因工程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)為目的．其基本原理可從以下四個方面考慮。（1)利用載體DNA在受體細(xì)胞中獨(dú)立于染色體DNA而自主復(fù)制的特性，將外源基因與載體分子重組，通過載體分子的擴(kuò)增提高外源基因在受體細(xì)胞中的劑量．借此提高其宏觀表達(dá)水平。這里涉及到DNA分子高拷貝復(fù)制以及穩(wěn)定遺傳的分子遺傳學(xué)原理?；蚬こ淘砑皩?shí)驗(yàn)技術(shù)

(2)篩選、修飾和重組啟動子、增強(qiáng)子、操作子、終止子等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并將這些元件與外源基因精細(xì)拼接．通過強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提高其表達(dá)水平。

(3)選擇、修飾和重組核糖體結(jié)合位點(diǎn)及密碼子等mRNA的翻譯調(diào)控元件。強(qiáng)化受體細(xì)胞中蛋白質(zhì)的生物合成過程。

上述(2)和(3)兩點(diǎn)均涉及到基因表達(dá)調(diào)控的分子生物學(xué)原理?；蚬こ淘砑皩?shí)驗(yàn)技術(shù)(4)基因工程菌(細(xì)胞)是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應(yīng)器，在強(qiáng)化并維持其最佳生產(chǎn)效能的基礎(chǔ)上，從工程菌(細(xì)胞)大規(guī)模培養(yǎng)的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應(yīng)器的增殖速度和最終數(shù)量，也是提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的主要環(huán)節(jié)，這里涉及的是生物化學(xué)工程的基本理論體系。因此．分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)以及生物化學(xué)是基因工程原理的三大基石?；蚬こ淘砑皩?shí)驗(yàn)技術(shù).四、生物工程等概念生物工程：直接或間接利用生物體的機(jī)能生產(chǎn)物質(zhì)的技術(shù)。包括發(fā)酵技術(shù)、基因重組、細(xì)胞融合、細(xì)胞大量培養(yǎng)、生物反應(yīng)器等技術(shù)。生物技術(shù)：是在細(xì)胞水平上，特別是在分子水平上對生物體遺傳性實(shí)現(xiàn)巨大的接近定向改造的一套內(nèi)容繁多和復(fù)雜的技術(shù)。包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等?；蚬こ淘砑皩?shí)驗(yàn)技術(shù)現(xiàn)代科技革命高新技術(shù)生物技術(shù)基因工程基因克隆基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)第二節(jié)

基因工程的發(fā)展歷史基因工程的發(fā)展歷史概括為三個階段

基因工程的誕生

基因工程的成熟基因工程的騰飛基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)一、基因工程的誕生

基因工程是一項(xiàng)新興的工程技術(shù)，它的誕生需要理論和技術(shù)上的支持理論上的三大發(fā)現(xiàn)技術(shù)上的三大發(fā)明基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA（基因工程的先導(dǎo)）DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理遺傳信息的傳遞方式（中心法則）1.理論上的三大發(fā)現(xiàn)基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)

證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA（基因工程的先導(dǎo)）：1944年首先用體外的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明基因的化學(xué)本質(zhì)就是DNA分子的是加拿大生物化學(xué)家艾弗里O.T.Avery（1877-1955）。他和他的合作者C．M．MacLeod及M．McCarty在紐約進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化的研究。

1)遺傳物質(zhì)是DNA基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)

體外的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明基因就是DNA分子基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)2).DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)Watson（沃森）andCrick（克里克）（1953）

美國遺傳學(xué)家Watson(J.Watson)和英國生物學(xué)家克里克(F.Crick)

1953年4月25日DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)假說（不到1000字的短文）《核酸的分子結(jié)構(gòu)——脫氧核糖核酸的一個結(jié)構(gòu)模型》在（自然）雜志上發(fā)表。1個月后在（自然）雜志上又發(fā)表了遺傳物質(zhì)的復(fù)制機(jī)理。1962年與M.H.F.Wilkins共獲諾貝爾生理學(xué)獎。DNA半保留復(fù)制機(jī)理的證明－Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)(1958)DNA復(fù)制模式的破解M.Meselson(MatthewMeselson,西爾遜)andF.W.Stahl(FranklinStahl,斯塔爾)(1958)1958年來西爾遜（Meselson）和斯塔爾（Stahl）首次在分子水平上成功地證明了DNA的半保守復(fù)制（semiconservativereplication）利用氮標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制(15N)

基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)DNA半保留復(fù)制圖基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)3）遺傳信息的傳遞方式（中心法則）

中心法則的確立F.Crick(1958)中心法則的確立F.Crick(1958)中心法則的確立F.Crick(1958）1958年克里克確立的中心法則(1971年修改),最早提出遺傳密碼這一名詞的是量子力學(xué)奠基人之一，奧地利物理學(xué)家施勒丁格(E．Schrodinger，1944)。第一個提出遺傳密碼具體設(shè)想的是美國物理學(xué)家G.Gamov，他通過推算提出了三聯(lián)體密碼子的概念，并且進(jìn)一步推論一種氨基酸可能不止有一個密碼子。第一個用實(shí)驗(yàn)破譯密碼子的是馬太(Matthaei)和尼倫伯格(Nirenberg)，1966M.NirenbergandH.Khorana（1968年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎獲得者）建立了完整的遺傳密碼表基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)DNA技術(shù)分子體外切割與連接技術(shù)限制性內(nèi)切酶(1970)和DNA連接酶(1967)發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著DNA重組時代的開始基因工程載體技術(shù)

1970載體（vector）的使用成功1970年，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)使真核基因的制備成為可能。2技術(shù)上的三大發(fā)明基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)DNA技術(shù)分子體外切割與連接技術(shù)

·

—限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶HindⅡ1970年，美國生化學(xué)家Simith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離提純了限制性核酸內(nèi)切酶

HindⅡ（1978年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎獲得者)EcoR1限制性核酸內(nèi)切酶(1972年Bover實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)）G↙AATTCDNA連接酶的發(fā)現(xiàn)：1967年世界上5個實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。1970年，在美國Khorana實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種高效連接活性的DNA連接酶—T4DNA連接酶

基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1970美國DulleccoTemin和Baltimore（1975年諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎獲得者）在腫瘤病毒中存在反轉(zhuǎn)錄酶打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。

DNA分子序列分析及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展也推動了基因工程的發(fā)展DNA分子的核苷酸序列分析技術(shù)，瓊脂糖凝膠電泳和Southern雜交技術(shù)等技術(shù)的展?；蚬こ梯d體技術(shù)1970載體（vector）的使用成功.1970年λ噬菌體導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)（轉(zhuǎn)化）1970年，逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn).基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1973年，美國斯坦福大學(xué)Boyer和Cohen等獲得了抗四環(huán)素和抗新霉素（卡那霉素）的重組菌落，標(biāo)志著基因工程的誕生。1973年建立的基因工程的基本模式為標(biāo)志的。他們將大腸桿菌體內(nèi)的兩個不同的質(zhì)粒提取出來，拼接成一個雜合的質(zhì)粒。當(dāng)雜合質(zhì)粒被導(dǎo)入大腸桿菌后，它能在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制并表達(dá)雙親質(zhì)粒的遺傳信息。這是基因工程的第一個成功的克隆轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

Tetracycline

pSC101EcoRIDNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetr基因工程的誕生標(biāo)志基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)基因工程的成熟

1977年日本的Itakura及其同事首次在大腸桿菌中克隆并表達(dá)了人的生長激素釋放抑制素基因。幾個月后．美國的Ullvich克隆并表達(dá)了人的胰島素基因。1978年，美國Genentech公司開發(fā)出利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進(jìn)生產(chǎn)工藝，從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。

基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)表1-1主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美國乙肝1986歐洲人白細(xì)胞介素1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)三、基因工程的騰飛：1.1982年，美國人，大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠；

2.1983年，美國人，Ti質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞（細(xì)菌Neor基因）

3.1990年，美國人，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SDID）

4.1990年，美國倡導(dǎo)，人類基因組計劃，15年時間30億USD；2000年6月26日各國科學(xué)家向全世界宣布“人類基因組計劃”工作草圖繪制成功，“基因”和“基因組研究”更是成為人們談?wù)摰慕裹c(diǎn)問題。2003人類基因組側(cè)序完成。5.1997年，英國，克隆多利綿羊基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)三、基因工程的騰飛：基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)四.基因工程的意義

基因工程可以繞過遠(yuǎn)緣有性雜交的困難，使基因在微生物、植物、動物之間交流，迅速并定向的獲得人類需要的新的生物類型概括地講，其意義體現(xiàn)在以下三個方面大規(guī)模生產(chǎn)生物分子；

設(shè)計構(gòu)建新物種；

搜集、分離、鑒定生物信息資源

基因工程原理及實(shí)驗(yàn)技術(shù)導(dǎo)致第四次工業(yè)大革命

1980年11月15日，美國紐約證券交易所開盤的20分鐘內(nèi)，Genentech公司的新上市股要