2025版高考生物二輪復(fù)習(xí)課件 第一部分 專題九 爭(zhēng)分點(diǎn)突破1 PCR技術(shù)與應(yīng)用

PCR技術(shù)與應(yīng)用爭(zhēng)分點(diǎn)突破

1一

核心提煉二

典例突破一、PCR技術(shù)“引物”歸類分析1.引物的設(shè)計(jì)(1)(2020·山東，25節(jié)選)通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是_______________________________________________________________________________。引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)(2)(經(jīng)典高考題節(jié)選)設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間發(fā)生_____________，而造成引物自連。同理也要避免引物之間的互補(bǔ)。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同且____________的引物需要設(shè)定更高的復(fù)性溫度。堿基互補(bǔ)配對(duì)G、C含量高(3)科學(xué)設(shè)計(jì)引物是PCR能否成功的關(guān)鍵，若引物的堿基過多或引物的G、C含量過高，會(huì)造成PCR的效率偏低，收獲的目的基因較少，原因是_______________________________________________________________。若對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)或多個(gè)條帶，從引物角度分析，原因可能是_____________________________。引物與模板鏈結(jié)合過于緊密，變性時(shí)引物不易與模板鏈脫離(影響變性)引物過短導(dǎo)致引物的特異性下降拓展

引物與復(fù)性溫度(1)復(fù)性溫度：復(fù)性溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)；復(fù)性溫度低，擴(kuò)增效率高。(2)引物：①引物長(zhǎng)度越長(zhǎng)，越容易形成氫鍵，為避免出現(xiàn)錯(cuò)配，需要適當(dāng)提高復(fù)性溫度；②引物GC含量越高，容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合，需要適當(dāng)提高復(fù)性溫度。2.引物的修飾(1)(2022·山東，25節(jié)選)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或PΔ的功能。①為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是_________________________________________________________，為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。能與P基因模板鏈3′端的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸5′端引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，因此設(shè)計(jì)擴(kuò)增P基因的引物，需要兩種引物分別與兩條模板鏈3′端的堿基序列互補(bǔ)。DNA聚合酶延伸時(shí)，是將脫氧核苷酸加到引物的3′端，為了不破壞目的基因，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的5′端。②PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖分析，出現(xiàn)該問題的原因是__________________________________________________________________________________________________。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoR

Ⅰ識(shí)別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是__________________________________________。P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時(shí)出錯(cuò)。由圖可看出，在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的最后兩個(gè)堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變，可通過在EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基，使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)，這樣能保證P基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA上的讀碼框不改變，能夠正常翻譯。(2)引物用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶識(shí)別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的在第一次PCR循環(huán)結(jié)束后，得到以引物Ⅱ延長(zhǎng)得到的單鏈。在以后的PCR循環(huán)中，以引物Ⅱ所形成的單鏈為模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA時(shí)，引物Ⅱ上的X片段也被作為模板合成子鏈。因?yàn)閮蓷l引物間的片段以指數(shù)倍數(shù)擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)束得到的絕大部分DNA片段是選項(xiàng)中的D。√3.引物的結(jié)合方向如圖為X蛋白的部分基因序列，所示序列為引物結(jié)合的部分，據(jù)圖分析：擴(kuò)增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________________；______________________________。5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′5′-TGATCTACGGCTTACA-3′書寫引物序列，一般從引物的5′端向3′端書寫，避免誤判。圖中位于上方的模板鏈5′端磷酸基團(tuán)在左側(cè)，3′端羥基在右側(cè)，可知與上方模板鏈配對(duì)的引物5′端在右側(cè)，3′端在左側(cè)，引物序列為5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推測(cè)另外一條引物的序列。4.引物的選擇(2023·山東，25節(jié)選)科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物_________________。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的_____(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。F1和R2(或F2和R1)a鏈據(jù)圖甲可知，引物F1與R2或F2與R1結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推測(cè)為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板鏈，而根據(jù)圖上啟動(dòng)子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是從左向右，對(duì)應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3′→5′，非模板鏈(a鏈)是5′→3′；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物結(jié)合的單鏈延伸方向是3′→5′；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對(duì)的單鏈?zhǔn)?′→5′的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。(2)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了_______________，條帶2所檢出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。J－V5融合蛋白不是重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平。分析題圖可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體檢測(cè)后，均有條帶1，說明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗體檢測(cè)后，出現(xiàn)條帶2，而用抗V5抗體檢測(cè)后，沒有出現(xiàn)條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。5.引物的數(shù)量計(jì)算(1)如圖：一個(gè)DNA分子n次擴(kuò)增，則：①子代DNA分子中等長(zhǎng)鏈的DNA分子數(shù)為________個(gè)；②子代DNA分子中不等長(zhǎng)鏈的DNA分子數(shù)為_____個(gè)；③子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為_____個(gè)；④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子數(shù)為________個(gè)；⑤復(fù)制過程中共需引物________個(gè)；⑥第n次復(fù)制需要引物______個(gè)。2n－2n2n22n－12n＋1－22n(2)已知引物1及引物2之間的序列為目的序列，若引物與DNA的結(jié)合位點(diǎn)如圖所示，在第_____輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條單鏈等長(zhǎng)的目的片段。2二、PCR產(chǎn)物鑒定——瓊脂糖凝膠電泳(2024·黑吉遼，7)關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C.在同一電場(chǎng)作用下，DNA片段越長(zhǎng)，向負(fù)極遷移速率越快D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測(cè)出來√瓊脂糖凝膠的濃度會(huì)影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據(jù)所需分離的DNA片段大小來選擇的。對(duì)于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質(zhì)粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因?yàn)樗鼈冃枰蟮目讖絹碛行нw移；而對(duì)于較小的DNA片段，比如PCR產(chǎn)物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確；凝膠載樣緩沖液中指示劑只是指示電泳進(jìn)度，當(dāng)指示劑前沿接近凝膠邊緣時(shí)，則停止電泳，它不能指示DNA分子的具體位置，B錯(cuò)誤；DNA片段的遷移速率與其大小成反比，即DNA片段越長(zhǎng)，遷移速率越慢，DNA遷移方向?yàn)閺呢?fù)極向正極，C錯(cuò)誤；瓊脂糖凝膠中的DNA分子與其中的核酸染料結(jié)合后，可在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來，D錯(cuò)誤。應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是________。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是__________________。為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖中A所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相三、常用PCR技術(shù)及原理1.利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式目的基乙和丙因反向連接如圖A所示，如果用引物乙和丙，若正確連接則會(huì)產(chǎn)生350bp片段，反向連接則不會(huì)出現(xiàn)；同理，若用引物甲和丙，無論正向連接還是反向連接均會(huì)產(chǎn)生450bp片段。根據(jù)圖B進(jìn)行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向連接會(huì)擴(kuò)增出400bp片段。2.利用重疊延伸PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變?nèi)鐖D為利用重疊延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定點(diǎn)突變(A/T堿基對(duì)變?yōu)镚/C)的過程。該過程需設(shè)計(jì)四種引物，其中引物A、D與蛋白a基因的兩端完全配對(duì)，引物B、C雖與蛋白a基因中部配對(duì)，但在欲引入突變的位置替換為突變后的堿基。通過多次獨(dú)立的PCR達(dá)到目的。下列說法不正確的是A.PCR1所用引物應(yīng)為引物A和BB.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的產(chǎn)物為模板C.PCR3無需額外加入引物D.PCR4的作用是大量擴(kuò)增突變基因√引物與模板的3′端結(jié)合，由圖PCR1的產(chǎn)物可知，PCR1所用引物應(yīng)為引物A和B，A正確；由圖可知，PCR1和PCR2均以原始DNA為模板，PCR3以PCR1和PCR2的產(chǎn)物為模板，PCR4以PCR3的產(chǎn)物為模板，B錯(cuò)誤；由圖可知，兩條鏈互為模板和引物，故PCR3無需額外加入引物，C正確；PCR4的作用是大量擴(kuò)增突變基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正確。3.利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)造融合基因融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來源的擴(kuò)增片段連接起來的方法，其過程如圖1所示。圖2是中間載體1和中間載體2(利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建成)構(gòu)建成葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體示意圖(限制酶酶切位點(diǎn)標(biāo)注于載體外側(cè))，葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體通過與葉綠體基因的同源重組，將目的基因整合于葉綠體DNA上的特定位點(diǎn)上。請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：(1)圖1第一階段中PCR至少進(jìn)行______次循環(huán)，才能獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA，第二階段中引物2與引物3部分堿基的____________關(guān)系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來。2互補(bǔ)配對(duì)分析圖1可知，在第一階段中，利用PCR技術(shù)進(jìn)行第一次擴(kuò)增(循環(huán))，得到的含有引物2、引物3的產(chǎn)物，其DNA雙鏈不等長(zhǎng)，該產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行第二次擴(kuò)增(循環(huán))，才能獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA。第二階段中引物2與引物3部分堿基的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來。(2)若通過融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設(shè)計(jì)_____種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有____種。86圖1顯示：通過融合PCR技術(shù)，每一次將兩個(gè)DNA片段拼接起來，需要4個(gè)引物，其中有2個(gè)起著“搭橋”作用。依此類推，若通過融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設(shè)計(jì)8種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有6種。(3)圖2中需使用______________(填限制酶)和DNA連接酶將兩中間載體構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體，途中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是__________。Spe

Ⅰ、Sal

Ⅰ復(fù)制原點(diǎn)圖2顯示：?jiǎn)?dòng)子和終止子的兩端分別有Spe

Ⅰ和Sal

Ⅰ的識(shí)別位點(diǎn)，葉綠體同源重組基因1與2之間也存在Spe

Ⅰ和Sal

Ⅰ的識(shí)別位點(diǎn)，因此圖2中需使用Spe

Ⅰ、Sal

Ⅰ和DNA連接酶將兩中間載體構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體，圖中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是復(fù)制原點(diǎn)。4.利用反向PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)。請(qǐng)據(jù)圖回答問題：(1)如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的引物必須是________(從表格引物①②③④中選擇，填編號(hào))。名稱DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列5′-AACTATGCGCTCATGA－－－－－－GCAATGCGTAGCCTCT-3′3′-TTGATACGCGAGTACT－－－－－－CGTTACGCATCGGAGA-5′引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′②④由于已知序列的外側(cè)是未知序列(如圖中待擴(kuò)增的未知序列)，因此無法設(shè)計(jì)引物。若要分析出已知序列兩側(cè)的未知序列，設(shè)計(jì)引物是關(guān)鍵，可以采用反向PCR技術(shù)。反向PCR的操作步驟可以分為兩步。第一步是連接成環(huán)，即用限制酶切割DNA，用DNA連接酶將其連接成環(huán)，即圖中Ⅰ酶切和Ⅱ連接過程。第二步是反向擴(kuò)增，即根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以環(huán)狀DNA兩條鏈為模板，從已知序列向未知序列方向進(jìn)行反向擴(kuò)增，利用TaqDNA聚合酶無法將DNA連接成環(huán)的特點(diǎn)，得到鏈狀DNA，即圖中Ⅲ擴(kuò)增過程。采用反向PCR擴(kuò)增未知序列，又因子鏈的延伸方向從5′→3′，可根據(jù)已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)PCR引物是5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，(2)對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是______。A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′B對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，得到片段F的完整序列，因?yàn)槠蜦是被限制酶EcoRⅠ剪切的兩端，所以5′端應(yīng)該是AATTC，對(duì)應(yīng)F片段的開頭，故選B。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)稱qPCR，靈敏度高特異性好，是目前檢測(cè)微小殘留病變的常用方法。將標(biāo)有熒光素的Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合后，在變性、復(fù)性、延伸的熱循環(huán)中，與待測(cè)樣本DNA配對(duì)結(jié)合的Taqman探針被Taq酶切斷，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光(如圖所示)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值(該值與待測(cè)樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān))。下列有關(guān)敘述正確的是A.每個(gè)模板DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸

基團(tuán)B.做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的

核苷酸序列合成1種引物和1種Taqman

探針C.在反應(yīng)過程中，需要細(xì)胞中的ATP為新

鏈的合成提供能量D.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，經(jīng)歷的循

環(huán)數(shù)越少，說明含有的病變的概率越小√DNA分子為反向平行的兩條鏈，每條鏈都含有1個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，則一個(gè)DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，A正確；做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成1對(duì)引物和1種Taqman探針，B錯(cuò)誤；在反應(yīng)過程中，dNTP為新鏈的合成提供能量，C錯(cuò)誤；若熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說明擴(kuò)增次數(shù)越少，說明更多的熒光探針與目的基因進(jìn)行了堿基互補(bǔ)配對(duì)，可推測(cè)獲得的核酸產(chǎn)物中含有病變的概率越大，D錯(cuò)誤。6.“雙脫氧法”基因測(cè)序(不定項(xiàng))(2024·湖南，15)最早的雙脫氧測(cè)序法是在PCR反應(yīng)體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子鏈延伸時(shí)，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，以加入ddATP的體系為例：若配對(duì)的為ddATP，延伸終止；若配對(duì)的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測(cè)。通過該方法測(cè)序某疾病患者及對(duì)照個(gè)體的一段序列，結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是A.上述PCR反應(yīng)體系中只加入一種引物B.電泳時(shí)產(chǎn)物的片段越小，遷移速率越慢C.5′-CTACCCGTGAT-3′為對(duì)照個(gè)體的

一段序列D.患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)镚√√利用雙脫氧測(cè)序法時(shí)，PCR反應(yīng)體系中加入的模板是待測(cè)的單鏈DNA，故只需加入一種引物，A正確；電泳時(shí)，產(chǎn)物的DNA片段越大，形成的阻力越大，遷移速率越慢，B錯(cuò)誤；根據(jù)題圖可知，對(duì)照個(gè)體PCR子鏈的測(cè)序結(jié)果為5′-CTACCCGTGAT-3′，該序列與對(duì)照個(gè)體雙鏈DNA分子中模板鏈的互補(bǔ)鏈的序列相同，患者為5′-CTACCTGTGAT-3′，對(duì)比可知，患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)門，C正確，D錯(cuò)誤。(1)雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每當(dāng)DNA鏈加入分子ddNTP時(shí)，延伸便終止。(2)每一次DNA測(cè)序是由4個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)組成的，4個(gè)PCR反應(yīng)體系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4個(gè)反應(yīng)體系分別加入不同的含有標(biāo)記的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反應(yīng)后，在反應(yīng)體系中就形成了大量起始點(diǎn)相同、終止點(diǎn)不同的DNA片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出來，得到放射性同位素自顯影條帶，依據(jù)電泳條帶讀取DNA雙鏈的堿基序列。(4)雙脫氧法原理示意圖：三

專題強(qiáng)化練1234567891011答案對(duì)一對(duì)題號(hào)12345678910答案DBADCDDABCABCABD題號(hào)11答案(1)PCR擴(kuò)增時(shí)未在引物上將S基因編碼終止密碼子的TGA刪除，導(dǎo)致融合基因翻譯提前終止，未表達(dá)出HA的氨基酸序列HA編碼序列的第一個(gè)堿基與HA編碼序列前的載體的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致HA的mRNA的密碼子被錯(cuò)誤讀取(2)R蛋白對(duì)S蛋白和N蛋白去磷酸化SPD可促進(jìn)R蛋白的表達(dá)(3)一方面，SPD通過促進(jìn)R蛋白表達(dá)，對(duì)N蛋白去磷酸化后間接降低S蛋白的磷酸化水平，從而抑制癌細(xì)胞增殖；另一方面，SPD通過促進(jìn)R蛋白表達(dá)對(duì)S蛋白去磷酸化，直接降低S蛋白的磷酸化水平，從而抑制癌細(xì)胞增殖1.(2024·長(zhǎng)沙高三模擬)PCR引物的3′端有結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5′端無嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是A.圖中兩條子鏈合成一定都是從5′端

向3′端延伸B.圖示表示復(fù)性階段，該過程的溫度與引物的長(zhǎng)短有關(guān)C.用圖示引物擴(kuò)增5次后，可以產(chǎn)生22個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物D.PCR每次循環(huán)都消耗引物和原料，在實(shí)驗(yàn)過程中需要及時(shí)補(bǔ)充√1234567891011答案TaqDNA聚合酶只能從引物的3′端開始延伸DNA子鏈，所以兩條子鏈合成一定都是從5′端向3′端延伸，A正確；圖示表示復(fù)性階段，該過程的溫度與引物的長(zhǎng)短、堿基組成等有關(guān)，引物長(zhǎng)度越長(zhǎng)或者GC堿基含量越高，則復(fù)性的溫度設(shè)置越高，B正確；經(jīng)過5次循環(huán)后會(huì)產(chǎn)生25＝32(個(gè))DNA，其中雙鏈不等長(zhǎng)的DNA有2×5＝10(個(gè))，因此擴(kuò)增5次后可以產(chǎn)生32－10＝22(個(gè))目標(biāo)產(chǎn)物，C正確；PCR所需要的引物和原料是一次性添加的，在實(shí)驗(yàn)過程中不需要補(bǔ)充，D錯(cuò)誤。1234567891011答案2.(2020·北京，12)為了對(duì)重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動(dòng)子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中(如圖)。為檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是A.①＋③

B.①＋②

C.③＋②

D.③＋④√1234567891011答案若要檢測(cè)獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，需要檢測(cè)是否含有高效啟動(dòng)子序列和HMA3基因序列，應(yīng)選擇的引物組合是①＋②，B符合題意。1234567891011答案3.(2024·鹽城高三模擬)關(guān)于DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的實(shí)驗(yàn)，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都

必須進(jìn)行高壓滅菌處理B.根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，加熱到

熔化，稍冷卻后加入核酸染料混勻C.電泳鑒定PCR產(chǎn)物時(shí)加樣緩沖液中的指示劑可提示終止時(shí)刻D.－20℃儲(chǔ)存的小份緩沖液和酶，使用前從冰箱拿出，需要緩慢融化√1234567891011答案PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前都必須進(jìn)行高壓滅菌處理，移液器不需要進(jìn)行高壓滅菌處理，A錯(cuò)誤；電泳鑒定PCR產(chǎn)物時(shí)加樣緩沖液中的指示劑溴酚藍(lán)遷移速度較快，可提示電泳的終止時(shí)刻，C正確；PCR所用緩沖液和酶從冰箱拿出之后，應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，這樣才能不破壞緩沖液中穩(wěn)定性較差的成分，同樣保護(hù)酶的活性不被破壞，D正確。1234567891011答案DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，且在本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有A.①②

B.②③

C.①④

D.③④4.(2024·山東，5)制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴(kuò)增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP)的反應(yīng)管①～④中，分別加入如表所示的適量單鏈√1234567891011答案制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等，①試管中的兩種單鏈能錯(cuò)位配對(duì)

，但是配對(duì)后伸出來的游離的單鏈?zhǔn)?′末端，因缺乏模板，無法利用原料進(jìn)行延伸，因此不能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針，①不符合題意；③試管中的兩種單鏈可以錯(cuò)位局部配對(duì)

，配對(duì)后伸出來的游離單鏈?zhǔn)?′端，是可以彼此提供模板和引物，并且利用堿基被熒光標(biāo)記的dATP進(jìn)行延伸的，③符合題意；1234567891011答案②和④試管加的都是1種單鏈DNA，試管中存在兩種可能：一是這條單鏈的3′端回折與自身一部分堿基配對(duì)，從而作為引物和模板，即

，但是配對(duì)區(qū)只有5個(gè)堿基對(duì)，即使經(jīng)過延伸最終只有8個(gè)堿基對(duì)，與題中“本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈DNA區(qū)”這句話相矛盾；二是加入適量同種單鏈，2條相同單鏈之間可以反向互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈區(qū)。對(duì)于②試管，配對(duì)后：

，配對(duì)區(qū)大于9個(gè)堿基對(duì)，但因伸出來的模板鏈堿基是AGA，導(dǎo)致延伸時(shí)堿基被熒光標(biāo)記的dATP無法摻入到子鏈合成中去，因此②不符合題意；1234567891011答案對(duì)于④試管，配對(duì)后：

，配對(duì)區(qū)大于9個(gè)堿基對(duì)，且伸出來的模板鏈堿基是TTC，堿基被熒光標(biāo)記的dATP必然可以摻入到子鏈合成中去，④符合題意。綜上，故選D。1234567891011答案5.以DNA復(fù)制為基礎(chǔ)的雙脫氧鏈終止法是最早的基因測(cè)序方法，在反應(yīng)體系中需加入ddNTP(有ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP4種，圖1)和dNTP(有dATP、dGTP、dCTP、dTTP4種，圖2)。當(dāng)以3′－CCATGCAC－5′為模板測(cè)定鏈中堿基A的位置時(shí)，子鏈復(fù)制延伸到第三位堿基A時(shí)，若與其配對(duì)的原料是ddTTP，則子鏈延伸終止；若與其配對(duì)的原料是dTTP，則子鏈繼續(xù)延伸；直到第七位的堿基A時(shí)，又會(huì)出現(xiàn)以上兩種配對(duì)的可能，這樣就能在一個(gè)體系中得出多種長(zhǎng)度的子鏈，再依此類推，可以知道模板鏈上的其他堿基的位置。圖3是以該技術(shù)的測(cè)序原理得到某DNA的電泳圖譜。下列說法不正確的是1234567891011答案A.每個(gè)反應(yīng)體系中應(yīng)加入相同的模板鏈、一種

ddNTP和四種dNTPB.ddNTP和dNTP都可脫去兩分子磷酸為反應(yīng)體

系提供能量和原料C.由圖3可知復(fù)制出的DNA子鏈的堿基序列是

5′—ATCGCATCAT－3′D.ddNTP的脫氧核糖3′上脫氧導(dǎo)致其無法連接

下一個(gè)核苷酸5′上的磷酸基團(tuán)√1234567891011答案雙脫氧鏈終止法是在相同的模板DNA鏈中分別加入一種ddNTP和四種dNTP的反應(yīng)體系中進(jìn)行，由于模板鏈相同，復(fù)制時(shí)DNA子鏈在進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)到T時(shí)，用到了對(duì)應(yīng)的ddATP、dATP，若隨機(jī)配對(duì)上的是ddATP，則該鏈復(fù)制停止，若隨機(jī)配對(duì)上的是dATP，則復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行，直到下一個(gè)對(duì)應(yīng)的堿基T又會(huì)重新出現(xiàn)上述配對(duì)的可能，1234567891011答案這樣在一個(gè)體系中就會(huì)因堿基T的配對(duì)而出現(xiàn)多條長(zhǎng)短不同的DNA鏈；依此類推，分別可以測(cè)出模板鏈堿基是A、C、G每個(gè)體系下的短鏈，再進(jìn)行凝膠電泳分離，最短的鏈跑得最快，最早合成，而子鏈的復(fù)制是從5′→3′的方向，所以由圖3可以讀出子鏈堿基序列從上到下為3′－ATCGCATCAT－5′，總共需要四個(gè)體系，分別測(cè)出四個(gè)堿基的順序，A正確，C錯(cuò)誤；1234567891011答案ddNTP和dNTP同時(shí)帶有特殊的化學(xué)鍵，且脫去兩分子磷酸后可以為DNA復(fù)制提供原料，B正確；由圖1和圖2可知，ddNTP和dNTP的區(qū)別在于五碳糖的3號(hào)位是否脫氧，ddNTP3號(hào)位為－H，無法與下一個(gè)脫氧核苷酸的磷酸基團(tuán)連接，D正確。1234567891011答案6.常見PCR只能擴(kuò)增兩引物之間的DNA序列，要擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知DNA序列，可用反向PCR技術(shù)。反向PCR技術(shù)擴(kuò)增的原理如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是A.酶切階段，L中不能含有

酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)

別序列B.環(huán)化階段，可選用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶C.圖中引物，應(yīng)選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)D.PCR擴(kuò)增，將溫度調(diào)至72℃的目的是使引物與模板鏈結(jié)合√1234567891011答案在酶切階段，已知序列L中不能含有酶切時(shí)所選限制酶的識(shí)別序列，不然會(huì)將已知序列L切斷，造成序列識(shí)別混亂，A正確；T4DNA連接酶或E.coliDNA連接酶都可以用來連接黏性末端，因此環(huán)化階段，可選用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶，B正確；1234567891011答案PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，為保證延伸的是已知序列兩側(cè)的未知序列，應(yīng)選擇引物1和引物4，且二者間不能互補(bǔ)配對(duì)，C正確；PCR擴(kuò)增中，將溫度調(diào)至72℃的目的是耐高溫的DNA聚合酶將4種脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，D錯(cuò)誤。1234567891011答案7.巢式PCR是指先后用外引物和內(nèi)引物擴(kuò)增目的基因的方法。其原理為先以比目的基因大的DNA片段為模板，用外引物(F1、R1)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量含目的基因的中間產(chǎn)物，再以擴(kuò)增后的中間產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物(F2、R2)擴(kuò)增目的基因，如圖所示。下列說法錯(cuò)誤的是A.兩對(duì)引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為

單鏈DNA片段B.第二輪PCR反應(yīng)能否進(jìn)行，是對(duì)第一輪

PCR反應(yīng)正確性的鑒定C.由于和兩套引物都互補(bǔ)的靶序列較少，

該技術(shù)可大大提高擴(kuò)增的特異性D.如果兩套引物一起加入反應(yīng)體系中，外引物的復(fù)性溫度應(yīng)顯著低于內(nèi)引物√1234567891011答案兩對(duì)引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為單鏈DNA片段，以便與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)，A正確；第二輪PCR使內(nèi)引物以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行再次擴(kuò)增，第二輪PCR反應(yīng)能否進(jìn)行，是對(duì)第一輪PCR反應(yīng)正確性的鑒定，B正確；由于和兩套引物互補(bǔ)的靶序列較少，該技術(shù)可大大提高擴(kuò)增的特異性，將需要的目的基因擴(kuò)增出來，C正確；1234567891011答案如果兩套引物一起加入反應(yīng)體系中，外引物復(fù)性溫度要明顯高于內(nèi)引物，使外引物先進(jìn)行反應(yīng)，D錯(cuò)誤。1234567891011答案8.(不定項(xiàng))乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，影響產(chǎn)量；釀酒酵母耐酸能力較強(qiáng)，但不產(chǎn)乳酸。研究者將乳酸菌內(nèi)催化乳酸生成的乳酸脫氫酶基因(LDH)導(dǎo)入釀酒酵母，獲得能產(chǎn)生乳酸的酵母工程菌株。圖示為通過雙酶切構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程。GTG為原核生物偏好的起始密碼子編碼序列，ATG為真核生物偏好的起始密碼子編碼序列。下列說法不正確的是A.引物2的3′端序列應(yīng)包含XbaⅠ的識(shí)別序列B.重組質(zhì)粒以能合成尿嘧啶的酵母菌株為受體C.PCR反應(yīng)時(shí)，緩沖液中一般要添加Ca2＋來激

活相關(guān)酶D.引物1的5′端序列應(yīng)考慮將GTG改為ATG√1234567891011答案√√根據(jù)題意可知，含GTG的一端為L(zhǎng)DH基因的起始端，為保證通過雙酶切以正確方向插入質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物1的5′端序列需要包含BamHⅠ的識(shí)別序列，引物2的5′端序列應(yīng)包含XbaⅠ的識(shí)別序列，A錯(cuò)誤；1234567891011答案結(jié)合題意可知，質(zhì)粒上有作為標(biāo)記基因的尿嘧啶合成酶基因，所以本過程中重組質(zhì)粒以不能合成尿嘧啶的酵母菌株為受體，然后在缺乏尿嘧啶的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不能合成尿嘧啶的釀酒酵母菌株不能生存，導(dǎo)入重組質(zhì)粒的釀酒酵母菌株因?yàn)楂@得了尿嘧啶合成酶基因可以正常生存，從而起到篩選作用，B錯(cuò)誤；1234567891011答案真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活，因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋，C錯(cuò)誤；設(shè)計(jì)引物1的5′端序列，應(yīng)考慮將編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉(zhuǎn)變?yōu)檎婧松锲玫腁TG，以便目的基因在酵母細(xì)胞中更好地表達(dá)，D正確。1234567891011答案9.(不定項(xiàng))(2024·長(zhǎng)沙高三模擬)熒光定量PCR是一種定量計(jì)算待測(cè)樣品的初始模板量的方法。在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光探針，熒光探針可以摻入新合成的DNA鏈中，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中的熒光強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算初始模板量。如圖為某熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。下列說法正確的是A.一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增出的

DNA量呈正相關(guān)B.每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光探針的量相同C.樣品甲的初始模板量大于樣品乙D.熒光強(qiáng)度不再變化時(shí)PCR反應(yīng)停止√1234567891011答案√√在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光探針，熒光探針可以摻入新合成的DNA鏈中，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，因此一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增出的DNA量呈正相關(guān)，A正確；最終各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度一樣，說明每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)添加的熒光探針的量相同，B正確；1234567891011答案PCR擴(kuò)增時(shí)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，因此DNA數(shù)量越多，熒光強(qiáng)度越大，樣品甲達(dá)到最大熒光強(qiáng)度所用的時(shí)間短于乙，因此樣品甲的初始模板量大于樣品乙，C正確；熒光強(qiáng)度不再變化可能是因?yàn)闊晒馓结樆蛟系认谋M，若為前者，此后PCR反應(yīng)仍在進(jìn)行，D錯(cuò)誤。1234567891011答案10.(不定項(xiàng))(2024·濟(jì)南高三一模)基因定點(diǎn)突變的目的是通過定向改變基因內(nèi)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基來改變多肽鏈上一個(gè)或幾個(gè)氨基酸。大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，過程如圖所示。下列敘述正確的是A.第一輪PCR過程中復(fù)性所用的溫度應(yīng)低于第二輪

PCR復(fù)性的溫度B.PCR擴(kuò)增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物需具備啟動(dòng)子、終止子

等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯C.第一輪PCR的產(chǎn)物的兩條DNA鏈作為第二輪PCR

所用的引物D.將某蛋白質(zhì)的第21位組氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，屬于蛋白質(zhì)工程√1234567891011答案√√為了使兩輪PCR反應(yīng)在同一支試管中進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮不同的復(fù)性溫度，第一輪PCR過程中復(fù)性所用的溫度應(yīng)低于第二輪PCR復(fù)性的溫度，A正確；若要使目的基因可以表達(dá)出蛋白質(zhì)，則產(chǎn)物需具備啟動(dòng)子和終止子，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，B正確；1234567891011答案除了第一輪產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的大引物外，第二輪PCR仍需加入另一種側(cè)翼引物，以便進(jìn)行另一條鏈的延伸，C錯(cuò)誤；將某蛋白質(zhì)的第21位組氨酸(CAC)改造成酪氨酸(UAC)，應(yīng)使誘變引物中包含ATG或TAC序列，該過程屬于蛋白質(zhì)工程技術(shù)范疇，D正確。1234567891011答案11.(2024·濱州高三二模)TGF－β信號(hào)通路可通過S蛋白去磷酸化抑制癌細(xì)胞增殖，該過程中N蛋白磷酸化后被激活，可使S蛋白發(fā)生磷酸化。藥物SPD可通過影響R蛋白來增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TGF－β信號(hào)通路的響應(yīng)。為探索藥物SPD治療癌癥的機(jī)理，需構(gòu)建基因表達(dá)載體以獲得融合蛋白S－HA、N－HA和R－HA。HA是一種短肽，連接在S、N或R蛋白的羧基端(不影響S、N或R的功能)，細(xì)胞中只有帶HA標(biāo)簽的融合蛋白能與介質(zhì)上的HA抗體結(jié)合，從而分離得到HA標(biāo)簽融合蛋白。1234567891011答案(1)用于PCR擴(kuò)增S基因的引物5′端分別加入了限制酶NheⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列，將擴(kuò)增后的S基因插入載體上，構(gòu)建含S－HA融合基因的表達(dá)載體，如圖1所示，