微生物快速檢測方法

微生物快速檢測方法常見微生物檢測項目常規(guī)微生物項目細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌致病微生物項目沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等傳統(tǒng)計數(shù)改良法1、培養(yǎng)膜法2、螺旋平板計數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計數(shù)3、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測快速檢測的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測量法常規(guī)微生物檢測方法免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。靈敏度增大，菌落無擴(kuò)散情況，便于計數(shù)。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主?；蛱结樂ㄒ话阋残枰鼍?，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強(qiáng)度。24小時可確定大腸桿菌數(shù)。RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。ATP＋螢光素+螢光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片，核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，26小時可確認(rèn)結(jié)果。ATP＋螢光素+螢光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；對微生物進(jìn)行核酸染色，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計數(shù)。熱效應(yīng)曲線圖的形成，是由于培養(yǎng)基含有多種成分，微生物則產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物，以此表現(xiàn)出的熱效應(yīng)為多個曲線峰，如為單一營養(yǎng)成分，則只有一個峰出現(xiàn)。培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)原理

二片塑料膜構(gòu)成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。操作方法：

檢樣稀釋→取1ml滴于下膜正中央→蓋上膜→擴(kuò)展器壓成20cm2圓圈→37℃培養(yǎng)24h→計數(shù)(顯色的斑點)培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)優(yōu)點：可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基?？晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時間、人力和費(fèi)用。因為有顯色劑和小方格，計數(shù)方便。節(jié)約稀釋的繁瑣動作?？煽焖贉y試致病菌，節(jié)省大量的實驗步驟。缺點成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測試細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時不能節(jié)約培養(yǎng)時間。培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)應(yīng)用細(xì)菌總數(shù)測試片中含有一種紅色指示染劑，使所有菌落易認(rèn)別計數(shù)。大腸菌群測試片中含有指示劑，使菌落為紅色，且有氣泡產(chǎn)生。大腸桿菌指示劑可使所有菌落為紅色，并可留住大腸桿菌產(chǎn)生的氣泡。24小時可確定大腸桿菌數(shù)。霉菌和酵母菌計數(shù)測試片中加入的抗生素，可以抑制細(xì)菌生長；指示劑使酵母菌易認(rèn)別計數(shù)；霉菌可產(chǎn)生特有的色澤。金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片，核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，26小時可確認(rèn)結(jié)果。培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動菌落計數(shù)儀原理樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。當(dāng)用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時，菌液體積減少，注入的體積和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時菌落沿注液線生長。用一計數(shù)的方格來校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計數(shù)每個區(qū)域的已知菌落數(shù)，在計算細(xì)菌濃度。螺旋平板法平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍阿基米德螺旋型軌跡螺旋平板法微生物在生長和代謝的過程中，能產(chǎn)生大量的代謝熱。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。供細(xì)菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測量管底部裝入電極插頭，即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進(jìn)行檢測。需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀2、螺旋平板計數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計數(shù)免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主。改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強(qiáng)度。優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)利用細(xì)菌生長時產(chǎn)生熱量的原理設(shè)計而成。樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。優(yōu)點與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計數(shù)儀，否則人工計數(shù)更麻煩。螺旋平板法濾膜法濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。優(yōu)點靈敏度增大，菌落無擴(kuò)散情況，便于計數(shù)。缺點需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。ATP生物熒光法原理ATP＋螢光素+螢光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光應(yīng)用用于食品生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測。用于水質(zhì)檢測。改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗。靈敏度增大，菌落無擴(kuò)散情況，便于計數(shù)。酶聯(lián)免疫技術(shù)—mini-Vidas全自動免疫分析儀ATP＋螢光素+螢光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光另外，有存在假陰性的可能。樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性標(biāo)記引入葡萄糖或其他糖類分子中。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強(qiáng)度。2、標(biāo)記，直接對活細(xì)胞和酵母進(jìn)行標(biāo)記；5、其它：熱量法，放射測量法免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)24小時可確定大腸桿菌數(shù)。RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值A(chǔ)TP法檢測成品的優(yōu)缺點微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層10秒獲得結(jié)果涂抹采樣混合:震蕩5s檢測表面清潔度/水質(zhì)檢測ATP生物熒光法ATP法檢測成品的優(yōu)缺點優(yōu)點：大大縮短庫存時間，減少物流壓力和成本。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，有存在假陰性的可能。ATP生物熒光法電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)原理

供細(xì)菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測量管底部裝入電極插頭，即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進(jìn)行檢測。阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等）被分解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集，增強(qiáng)了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能，從而降低了其阻抗值。

M=(R0-RT)/R0×100%其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值

RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分?jǐn)?shù)。電阻越小細(xì)菌活動越多，在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位的對數(shù)Log(CFU)與IDT（阻抗檢測時間）呈直線關(guān)系。電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)優(yōu)缺點：電阻抗法較省力，樣品細(xì)菌數(shù)在4～18小時內(nèi)出結(jié)果。但對于菌數(shù)太低的不好，樣品中還不能用防腐劑，否則結(jié)果是亂七八糟的。電阻抗法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中工作量較大，但以后的檢測簡便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測量管一只。電阻抗法測定細(xì)菌總數(shù)通過顏色變化檢測微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點的時間。與阻抗法類似，可以實現(xiàn)快速檢測。缺點：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強(qiáng)度。光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。流式細(xì)胞技術(shù)

原理液體樣品流過儀器中的激光照射的流動池，當(dāng)微生物流過顯微鏡聚焦的流動池時就能被自動地檢測到。特點檢測方法與使用的儀器有高度的特異性，所以應(yīng)遵循生產(chǎn)廠商提供的方法。

FOSS公司BactoScanFC牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀采用流式細(xì)胞原理。對微生物進(jìn)行核酸染色，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計數(shù)。優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)缺點：死活細(xì)胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細(xì)菌總數(shù)。流式細(xì)胞技術(shù)

美國Chemunex公司微生物快速檢測系統(tǒng)將流式細(xì)胞技術(shù)與活細(xì)胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。其最大的特點是只檢測活細(xì)胞數(shù)，速度極快，處理量大。檢測步驟：1、過濾；2、標(biāo)記，直接對活細(xì)胞和酵母進(jìn)行標(biāo)記；3、激光掃描。流式細(xì)胞技術(shù)

三種型號的差異√√利用細(xì)菌生長時產(chǎn)生熱量的原理設(shè)計而成。微生物在生長和代謝的過程中，能產(chǎn)生大量的代謝熱。由于各種微生物的代謝產(chǎn)物熱效應(yīng)不同，因此可顯示出特異性的熱效應(yīng)曲線圖。熱效應(yīng)曲線圖的形成，是由于培養(yǎng)基含有多種成分，微生物則產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物，以此表現(xiàn)出的熱效應(yīng)為多個曲線峰，如為單一營養(yǎng)成分，則只有一個峰出現(xiàn)。在細(xì)菌生長的過程中，用微量量熱計測量產(chǎn)熱量等熱數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機(jī)處理，繪制成以產(chǎn)熱量對比時間組成的熱曲線圖，以此推斷細(xì)菌存在數(shù)量。微量量熱法發(fā)射測量法利用細(xì)菌在代謝碳水化合物時產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性標(biāo)記引入葡萄糖或其他糖類分子中。細(xì)菌生長時，糖被利用并放出標(biāo)記的CO2，將生成的放射性標(biāo)記CO2從培養(yǎng)裝置中導(dǎo)出或用化學(xué)法吸收后，利用專用的放射測量儀來測定放射性CO2。放射量與菌數(shù)成正比。致病菌快速檢測方法顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主?；蛐酒@色培養(yǎng)基法原理在選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上經(jīng)過改良。利用細(xì)菌特有的生理生化反應(yīng)，使培養(yǎng)基中的指示劑產(chǎn)生顏色變化，以將目標(biāo)菌與其他菌區(qū)別開來酶聯(lián)免疫技術(shù)—mini-Vidas全自動免疫分析儀利用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本。優(yōu)點是檢測