DB22T 2394-2015 豬誘導(dǎo)多潛能干細胞(iPSCs)的制備和鑒定

備案號：48409-2016DB22DB22/T2394—2015豬誘導(dǎo)多潛能干細胞（iPSCs）的制備和鑒定Regulationofpreparationandidentificationofinducedpluripotentstemcellsfrompigs吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1本標準規(guī)定了源于豬胎兒成纖維細胞的豬誘導(dǎo)多潛能干細胞（iPSCs）的工作區(qū)條件、主GB/T6682分析實驗室用水規(guī)GB/T24863畜禽細胞體外培養(yǎng)與SN/T2330化妝品胚胎和發(fā)育毒性從妊娠25-30天豬胎兒中，去頭、尾、四肢、骨骼、內(nèi)臟后，消化分離獲得的有良好增24.1工作區(qū)域一般由準備室、緩沖間、無菌室、細胞超凈工作臺、生物安全柜、冰箱、液氮生物容器、離心機、CO2培養(yǎng)箱、純水裝置、高壓蒸汽滅菌所用玻璃器皿和金屬器材的清洗與消毒按照GB/各種使用液均用去離子水配制，充分溶解，立即用0.22μm濾膜濾過除菌，除特無菌手術(shù)取出妊娠25d～30d的豬子宮，兩端扎緊后運回實驗室，將子宮整個浸泡于75%的酒消毒30s，將消毒后的子宮送入細胞培養(yǎng)室中，剪開子宮，取出羊膜完整的胎兒置于75%的酒精中浸泡30s，取出用PBS洗3次后移入生物安全柜中。用剪刀將胎兒去除頭、尾、四肢、內(nèi)臟、脊椎骨及肋3箱中消化15min，間隔2min～3min吹打一次。消化結(jié)束后加入10ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM終加入10ml含10%FBS的DMEM將細胞重懸，移入2個T-75培養(yǎng)瓶中，每瓶再加入10ml培養(yǎng)液，置于），將包含4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc4，參見附錄）和綠色熒光蛋白（GFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒（pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc和pMX-GFP)及輔助質(zhì)粒Vsvg分別轉(zhuǎn)入DH5α感受向每管細菌中加入液體LB培養(yǎng)基900μl中培養(yǎng)12h。出現(xiàn)明顯菌落后，使用小槍頭挑取菌落置于5ml含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37將上述菌液加入到200ml新鮮含氨芐青霉素液體LB培養(yǎng)基中，37℃下200rpm震蕩12h，用OMEGA用T-75培養(yǎng)瓶和293細胞培養(yǎng)基，在37.5℃、5%CO2將pMX-Oct4、pMX-Klf4、PMX-Sox2、pMX-C-myc、pMX-GFP和Vsvg質(zhì)粒各10μg加入1mlOpti-MEM溶液混勻并室溫孵育20min。將上述溶液加入293GP細胞中晃勻后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第4天，收集293GT細胞培養(yǎng)液，使用0.45μm濾器過濾，標記好后置于4℃冰箱保存；再向4），ES培養(yǎng)液于37.5℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。此后每天換一次培養(yǎng)液，于D在體視顯微鏡下挑取形態(tài)較好，邊界清晰的原代iPSCs克隆，使用玻璃針（制作見附錄A.18）邊緣與飼養(yǎng)層細胞分開，從一端輕輕地將克隆推起，將克隆吸出，輕輕吹打使其分散成若干較小的克用堿性磷酸酶染液對所獲細胞克隆進行染色克隆細胞經(jīng)洗滌、固定、透化、封閉后，向各培養(yǎng)孔中分別加入200μl用1%BSA溶液以1:100的比例稀釋的一抗（兔抗-Oct4:ab18976;兔抗-Nanog:ab80892、兔抗-Rex1:ab50828、鼠抗-SSEA-4:ab16287放入培養(yǎng)箱中37℃孵育3h；PBS洗滌3次，將一抗溶液吸盡，PBS洗滌3次，每次5min；每孔中加入2008.7.2.34’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色將二抗溶液吸盡，避光PBS洗滌3次，每次5min。每孔中加入200μlDAPI染色液（D9542，40mg/mL），5將培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下觀察、拍照分析。豬iPSCs克隆均呈Oct4、Nanog、Rex1陽性，為綠色使用1mg/ml的IV型膠原酶將iPSCs克隆從飼養(yǎng)層上消化下來，將其與飼養(yǎng)層細胞分離，收集到無用BioRTcDNA第一鏈合成試劑盒獲得cDNA；以該cDNA為模板，用目的基因特異性引物（Oct4:F-gtcgccagaagggcaaac,R-cagggtggtgaagtgaggg,125bp;Sox2:F-ccctgcagtacaaR-aagacggcctccaaatcactg,614bp）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件按試劑盒說明設(shè)定。凝膠電泳檢查反應(yīng)產(chǎn)物，獲得各基因的相應(yīng)大小的產(chǎn)物即證明所獲豬iPSCs克隆表達上述外源基因（用皮下注射法將2×l06的iPSCs注射到免疫缺陷的裸鼠皮下組織中，3周～4周后手術(shù)取畸胎瘤組織，進行常規(guī)固定、脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色或免疫組織化學(xué)染色，觀察三胚每月應(yīng)專人定期往液氮生物容器中補充液氮，保持液氮量不6取青霉素0.5g，硫酸鏈霉素0.5g，溶于100ml水中，分裝為1ml/管。臨用前從冰箱中取出，每2HPO42.1g，KH2PO40.1g，溶于1000ml水中，調(diào)pH7.2處；使用時1ml貯液+7.0mlDMEM+2.0mlNBS，每個Ф35mm培養(yǎng)皿加入蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g7堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）+1000將小鼠ES細胞以1:2比例在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上傳代培養(yǎng)。以后每48小時收集培養(yǎng)液1次,消化液消化，37.5℃、5%CO2下培養(yǎng)于含DMEM+10%NBS+1%雙抗的培養(yǎng)液（M1）中。待細胞70%～80%匯合時，棄舊液，加入1ml絲裂酶素C，繼續(xù)培養(yǎng)3h～4h；取出培養(yǎng)皿，吸棄絲裂酶素C，用PBS液清洗4～5次，加入適量胰蛋白酶液，室溫放置3min～5min，在倒置顯微鏡下觀現(xiàn)明顯界限時，加入2ml新鮮M1終止消化；吹打成單細胞懸液，將細胞懸液移入一支10ml離心管中，600r/min離心3min，棄上清；用M1再次洗滌細胞1次～2次，調(diào)整細胞密度mm培養(yǎng)皿或24孔培養(yǎng)板中，或制作成飼養(yǎng)層微滴（每滴75～100μl，上覆礦物油），置37℃、5%CO2、從37℃培養(yǎng)了16h～17h的平板培養(yǎng)基上挑取一個單個DH5α菌落，接的試管中，37℃振蕩過夜；次日取50μl菌液接種于5m8接產(chǎn)物，冰浴30min，42℃水浴熱沖擊2min，冰浴5min；加入1ml37青霉素37℃振蕩培養(yǎng)1h，4000r/min離心1min，吸棄1mlLB培養(yǎng)基，留下10挑取單菌落接種于30ml含50μg/ml氨芐物接種于500ml含氨芐青霉素的LB中，37℃搖床培養(yǎng)16h～20h；4℃、5000rpm離心10min，收集菌體；將細菌沉淀重懸于10ml冰浴的溶液I（50mmol/L葡萄糖+25mmol/LTrIII（5mol/L乙酸鉀60ml+冰醋酸11.5ml+一蒸水28.離心10min，棄上清，敞開瓶口倒置離心瓶，棄盡上清；室溫下用70%乙醇洗滌沉淀和管將細胞樣品用適量4%多聚甲醛/PBS溶液室溫固定15min，（2%巴比妥鈉2ml+3%β-甘油磷酸鈉2ml+2%無水氯化鈣4ml+2%硫酸鎂0.2ml+蒸餾水1ml，混勻后調(diào)RNA的提取用RNAisoPlus試劑盒進行。棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，使用PBS輕輕漂洗2遍，加入1mlRNAisoPlus反復(fù)吹打?qū)⒓毎呀?；將液體轉(zhuǎn)移至1ml無酶的離心管中，室溫放置5min；加入200冷的氯仿劇烈震蕩15s，室溫靜置5min；12000g4℃下離心15min，將上清400μl轉(zhuǎn)離心管中，注意不要碰到中間的蛋白層，加入400μl異丙醇上下顛倒混勻；靜置10min，12000心管倒置在濾紙上，去盡酒精，室溫靜置5min左右；等沉淀干燥后，加入20μlDEP9遍，然后每個T25的培養(yǎng)瓶中加入2ml膠原酶IV，在5%CO2、37.