動(dòng)物性食品微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物性食品微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一、食品檢驗(yàn)中常用培養(yǎng)基的配制

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笳莆张囵B(yǎng)基的配制過(guò)程。認(rèn)識(shí)培養(yǎng)基的組成特點(diǎn)掌握高壓滅菌的原理和操作方法二、培養(yǎng)基的分類(lèi)培養(yǎng)基的定義:人工方法配合而成的專(zhuān)供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基按形態(tài)分類(lèi):固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基按功能分類(lèi):按功能分類(lèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)要求相同的微生物,所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)除少數(shù)幾種不同外,其它大部分都是共同的。因此可以配成一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基,再按照某一種微生物的特殊需要,添加某種營(yíng)養(yǎng)物即可。增菌培養(yǎng)基根據(jù)某種微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求,可配制出適合于這種微生物而不適合其他微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。增菌培養(yǎng)基的選擇性只是相對(duì)的,是純化微生物過(guò)程的一個(gè)步驟。選擇性培養(yǎng)基含有營(yíng)養(yǎng)物（增菌劑）和抑菌劑（選擇劑）,通過(guò)抑菌劑的選擇性抑制作用,使所要分離的微生物得到較好的繁殖,而其他菌被抑制。抑菌劑的種類(lèi)很多,如孔雀綠、煌綠、亞硒酸鈉、硝酸鹽、膽鹽等。鑒別培養(yǎng)基主要加入指示劑，如伊紅、美蘭。伊紅是酸性染料，美蘭是堿性染料。一般鑒別培養(yǎng)基選擇性鑒別培養(yǎng)基:如亞硫酸鉍瓊脂中的亞硫酸鉍和煌綠，既是抑菌劑，又是指示劑。生化反應(yīng)鑒別培養(yǎng)基厭氧菌培養(yǎng)基

三、培養(yǎng)基配制的一般過(guò)程

認(rèn)識(shí)該培養(yǎng)基的配方和組成特點(diǎn)。按照所須配制的量,進(jìn)行計(jì)算稱(chēng)量。先用大約3/4體積的水溶解。必要時(shí),可加熱促進(jìn)成分的溶解。用堿或酸調(diào)節(jié)pH值至所須的酸堿度,補(bǔ)足剩余水分。根據(jù)需要與否,加入瓊脂粉（條）,煮沸直至完全溶解,并補(bǔ)足所揮發(fā)水分。分裝至試管或鹽水瓶等,包扎待滅菌。四、本次實(shí)驗(yàn)中須配制的培養(yǎng)基1、計(jì)數(shù)瓊脂：用于細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定2、乳糖膽鹽發(fā)酵管：用于大腸菌群的測(cè)定3、麥康凱瓊脂：可用于腸桿菌菌科的鑒別培養(yǎng)4.馬鈴薯瓊脂：用于霉菌的分離和培養(yǎng)計(jì)數(shù)瓊脂成分:蛋白胨10g牛肉粉3g氯化鈉5g蒸餾水1000ml瓊脂粉15g制法:將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)。按正pH至7.27.4。加入瓊脂，加熱煮沸。使瓊脂溶化。分裝，高壓滅菌121℃，15min。附注:此培養(yǎng)基可供一般細(xì)菌培養(yǎng)之用，可傾注平板或制成斜面，如用于菌落計(jì)數(shù)，瓊脂量為1.5%，如作成平板或斜面，則應(yīng)為1.8%。乳糖膽鹽發(fā)酵管成分:蛋白胨20g膽鹽5g乳糖10g蒸餾水1000ml0.04%溴甲酚紫水溶液25mlpH7.4制法:將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝每管10ml，并放入一個(gè)小倒管，高壓滅菌115℃，15min。附注:雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。麥康凱瓊脂:蛋白胨17g眎胨3g乳糖10g豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g氯化鈉5g蒸餾水1000ml0.5%中性紅水溶液5ml0.01%結(jié)晶紫水溶液10ml瓊脂17g制法:（1）將蛋白胨、眎胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400ml蒸餾水中，校正pH至7.2；將瓊脂加入于600ml蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒瓶?jī)?nèi)，高壓滅菌121℃15min備用。（2）臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖。冷至5055℃時(shí)，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻傾注平板。附注:結(jié)晶紫有中性紅溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌?？捎糜谀c桿菌菌科的鑒別培養(yǎng)

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）成分:馬鈴薯（去皮切碎）300g葡萄糖20g瓊脂20g蒸餾水1000ml制法:將馬鈴薯去皮切碎，加蒸餾水至1000ml，煮沸1020min，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至1000ml，然后加葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，高壓滅菌121℃，15min。用途:分離培養(yǎng)霉菌。五、分工第1、2組：計(jì)數(shù)瓊脂

第3.4組：乳糖膽鹽發(fā)酵管第5組：麥康凱瓊脂

第6組：馬鈴薯瓊脂實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定一、目的和要求學(xué)習(xí)并掌握環(huán)境和食品中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的方法。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明細(xì)菌總數(shù):指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。主要作為食品被污染程度的標(biāo)志。菌落總數(shù)的測(cè)定，只包括一群能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數(shù)。三、實(shí)驗(yàn)材料土壤水源過(guò)期變質(zhì)的牛奶市場(chǎng)上銷(xiāo)售的變質(zhì)食品四、實(shí)驗(yàn)步驟以無(wú)菌操作,將檢樣25g（25ml）剪碎放于含有225ml滅菌生理鹽水的廣口瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)置有適量玻璃珠）或滅菌研缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨作成1∶10的均勻稀釋液。用1.0ml滅菌吸管吸取1∶10稀釋的稀釋液1ml,注入含有9.0ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)液面）,振搖試管混合均勻,作成1∶100的稀釋液。另取1.0ml滅菌吸管,按上項(xiàng)操作10倍遞增稀釋,如此每遞增稀釋一次,即換1支1.0ml吸管。根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)?biāo)本污染程度的估計(jì),選擇3個(gè)適宜稀釋度,分別作10倍遞增稀釋的同時(shí),即以吸取該稀釋度的吸管移1.0ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。將涼至55℃營(yíng)養(yǎng)瓊指注入平皿約15ml,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1.0ml滅菌生理鹽水的平皿內(nèi)作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平板,置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h（肉、水產(chǎn)品、乳和蛋品為48h）取出,計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù),乘以稀釋倍數(shù),即得每g（或ml）樣品所含菌落總數(shù)。五、計(jì)算方法1.平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2代表全皿菌落數(shù)。2.稀釋度的選擇（1）應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。（2）若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)在30300之間，則視二者之比如何來(lái)決定。若其比值小于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字。（3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。附表例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)（個(gè)/g/ml）報(bào)告方式（個(gè)/g/ml）10--110-210-31234567多不可計(jì)多不可計(jì)多不可計(jì)多不可計(jì)270多不可計(jì)164295271多不可計(jì)1103052046603135012—1.62.2————164003775027100313000270<1×103050016000或1.6×10438000或3.8×10427000或2.7×104310000或3.1×105270或2.7×102<1031000或8.1×104實(shí)驗(yàn)三揚(yáng)州市區(qū)二道河河水細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)三食品中大腸菌群數(shù)的測(cè)定

一、目的要求學(xué)習(xí)并掌握食品和水中大腸菌群測(cè)定的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)說(shuō)明大腸菌群:指一群在37℃，24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌群主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。食品中大腸菌群數(shù)系以每100ml（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）來(lái)表示，其含義是指100ml（g）食品內(nèi)含有大腸菌群數(shù)的實(shí)際數(shù)值。三、實(shí)驗(yàn)器材1、設(shè)備和材料天平、顯微鏡、均質(zhì)器或研缽，平皿、試管、吸管、載玻片。2.培養(yǎng)基及試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管；伊紅美藍(lán)瓊脂平板；乳糖發(fā)酵管；蛋白胨水；革蘭氏染液。3．肉制品；乳制品；城市河道水源。四、方法步驟（一）檢樣稀釋以無(wú)菌操作將檢樣25ml（或25g）放于含有225ml滅菌生理鹽水上或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌研缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以800010000rpm的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。2.用1ml吸管，吸取1∶10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻作成1∶100的稀釋液。3.另取1ml滅菌吸管，按上項(xiàng)操作依次作10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸管。4.根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。（二）乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在1ml以上者,用雙料乳糖發(fā)酵管,1ml及1ml以下者,用單料乳糖發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管,置37℃溫箱內(nèi),培養(yǎng)24h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報(bào)告為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)氣者,則按下列程序進(jìn)行。（三）分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)或麥康凱瓊脂平板上,置37℃溫箱內(nèi),培養(yǎng)1824h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報(bào)告為大腸菌群陰性。檢樣稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管37℃，24小時(shí)不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性報(bào)告伊紅美藍(lán)瓊脂平板或麥康凱平板，37℃，18

24小時(shí)革蘭氏染色乳糖微量發(fā)酵管，37℃，24小時(shí)革蘭氏陽(yáng)性大腸菌群陰性報(bào)告革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報(bào)告大腸菌群陽(yáng)性報(bào)告（四）證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上,挑取可疑大腸菌群落12個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色,同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管,置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣,革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌,即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果查大腸菌群數(shù)表得出本次實(shí)驗(yàn)值。

大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表檢

樣

量MPN100ml95%可信限1ml（g）×30.1ml（g）×30.01ml（g）×3下

限上

限000000000123<30306090<590000011110123306090120<51300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150<510200210111111110123701101501901030230360111122220123110150200240303609191111333301231602002402902222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000>240003607101500130002400048000注：1、本表采用3個(gè)稀釋度1ml（g），0.1ml（g），0.01ml（g），每稀釋度3管。2.表內(nèi)所列檢樣量如改用10ml（g），1ml（g），和0.1ml（g）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)降低10倍；如改用0.1ml（g），0.01ml（g）和0.001ml（g）時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)增加10倍，其余可類(lèi)推。實(shí)驗(yàn)四鮮血瓊脂的制作

一、目的要求掌握綿羊、家兔、雞等常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的采血方法和鮮血瓊脂的制作,充分認(rèn)識(shí)鮮血平板在細(xì)菌檢驗(yàn)中的應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)材料

1.碘酊，酒精棉球，3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑，消毒的50mL或25ml注射器，鑷子，煎毛剪。2.保溫在5055℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂。三、采血步驟

1．采血的途徑1）家兔:在心跳最明顯處進(jìn)針（一般在左側(cè)第三肋骨距胸骨4cm處）。

2）雞:觸摸雞的胸骨，用手指輕按至凹陷，用9號(hào)針頭向下插入1~2cm，再水平進(jìn)針，直至插入心臟。3）羊:將羊按倒，保定，剪除頸部羊毛，用手按住向心端，至血管暴露，用9或12號(hào)針頭，刺入頸靜脈。2.采血過(guò)程1）將注射器，鑷子，針頭煮沸滅菌。2）保定采血?jiǎng)游铮羧ゲ裳课坏拿?，用碘酊消毒，再用酒精棉球脫碘?）按照實(shí)際采血量的5%吸入抗凝劑。按照正確的部位將針頭刺入血管，抽取適量的血。將血注入滅菌的瓶子，或用酒精棉球封住針孔，以防細(xì)菌進(jìn)入。3.鮮血平板的澆注將預(yù)冷至5055℃的瓊脂，打開(kāi)瓶塞，拔下注射器針頭，加入510%的血量，顛倒混勻(注意不能產(chǎn)生氣泡)，立即傾注平板。制好的血平板應(yīng)為鮮艷的紅色。實(shí)驗(yàn)五腸桿菌科主要菌屬的鑒別一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)掌握食品衛(wèi)生上有重要意義的腸桿菌科重要菌屬的生化特性及其鑒別要點(diǎn)。二、實(shí)驗(yàn)材料1.提供菌種沙門(mén)氏菌；大腸桿菌；志賀氏菌；變形桿菌。2.提供鑒別試劑1）發(fā)酵管包括葡萄糖，乳糖，麥芽糖，甘露醇，蔗糖，尿素酶，枸櫞酸鹽，硫化氫等。2）蛋白胨水3）葡萄糖蛋白胨水4）三糖鐵瓊脂5)以及各種選擇性培養(yǎng)基。BS平板、DHL平板、EMB平板、麥康凱平板。三、實(shí)驗(yàn)步驟及方法1.將4種細(xì)菌分別接種糖發(fā)酵管。2.將4種細(xì)菌分別接種蛋白胨水和葡萄糖蛋白胨水，進(jìn)行吲哚試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)檢測(cè)。3.將4種細(xì)菌分別接種麥康凱平板4.將4種細(xì)菌分別接種三糖鐵瓊脂5.將4種細(xì)菌分別接種BS平板、DHL平板、EMB平板，比較其生長(zhǎng)特點(diǎn)。6.細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察吲哚試驗(yàn)原理蛋白質(zhì)中的色氨酸有些細(xì)菌如大腸埃希氏菌吲哚對(duì)位二甲基氨基苯甲醛+玫瑰吲哚紅色①試劑配方一：對(duì)二甲基氨基苯甲醛 1g無(wú)水乙醇 95mL濃鹽酸 20mL②試劑配方二：對(duì)二甲基氨基苯甲醛5g戊醇（或異戊醇）75mL濃鹽酸

25mL先用乙醇溶解試劑后加鹽酸,避光保存。M.R試驗(yàn)接種大腸桿菌或沙門(mén)氏菌于5mL葡萄糖蛋白胨水中,置37℃培養(yǎng)3-5d）；于培養(yǎng)物中加入幾滴試劑；變紅色者為陽(yáng)性反應(yīng),桔紅到黃色則為陰性。M.R試劑陽(yáng)性陰性V-P試驗(yàn)接種大腸桿菌或沙門(mén)氏菌于1mL葡萄糖蛋白胨水中,置37℃培養(yǎng)3-5d）；于培養(yǎng)物中加入0.5mLV-P甲液；隨后加V-P乙液0.5mL,輕搖；靜置10-15min。15min內(nèi)變紅者為陽(yáng)性。V-P甲液V-P乙液陽(yáng)性陰性M.R與V-P試驗(yàn)原理M.R試驗(yàn):甲基紅是一種pH指示劑:當(dāng)細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸且產(chǎn)酸量大時(shí)；在加入甲基紅指示劑后顯紅色為陽(yáng)性。pH4.4-6.2

紅→黃葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇2,3-丁二烯醇某些細(xì)菌能發(fā)酵二乙酰堿V-P試驗(yàn):+胨中的胍基化合物注意:通常M.R和V-P試驗(yàn)是密切相關(guān):如果一個(gè)微生物M.R是陽(yáng)性，則V-P是陰性；或者相反。粉紅色化合物+三糖鐵瓊脂斜面產(chǎn)酸（黃色）底部產(chǎn)酸（黃色）產(chǎn)氣＋H2S－反應(yīng)模式表示:A／A＋；－吲哚、M.R、V-P試驗(yàn)結(jié)果大腸桿菌沙門(mén)氏菌吲哚試驗(yàn)M.R試驗(yàn)V-P試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)M.R試驗(yàn)V-P試驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察與記錄實(shí)驗(yàn)六食品中沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)一、目的和要求熟悉并掌握對(duì)可疑食品中沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)程序和鑒定方法。背景知識(shí):1）沙門(mén)氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類(lèi)和動(dòng)物發(fā)病和食物中毒的主要病原菌。2）食品中沙門(mén)氏菌的含量較少，且常由于食品加工過(guò)程使其受到損傷而處于瀕死的狀態(tài)。故為了分離食品中的沙門(mén)氏菌，對(duì)某些加工食品必須經(jīng)過(guò)前增菌處理，用無(wú)選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的沙門(mén)氏菌恢復(fù)其活力，再進(jìn)行選擇性增菌，使沙門(mén)氏菌得以增殖而大多數(shù)的其它細(xì)菌受到抑制。二、實(shí)驗(yàn)材料

1.檢驗(yàn)對(duì)象a.預(yù)先準(zhǔn)備的各種肉制品，鮮肉；罐頭；鹽水鵝；b.從市場(chǎng)中采集的其它可疑食品。2.載玻片；滅菌試管；滴管；滅菌燒杯；勻漿器；滅菌生理鹽水；天平3.沙門(mén)氏菌菌種，以雞白痢、雞傷寒為宜。三、檢驗(yàn)步驟1.對(duì)可疑食品進(jìn)行總體觀察，判斷其氣味、色澤，罐頭食品是否有胖聽(tīng)現(xiàn)象等。2.對(duì)于凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過(guò)前增菌。方法是以無(wú)菌操作取25g（ml），加在裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml廣口瓶?jī)?nèi)。固體食品可先磨碎或乳化，于37℃培養(yǎng)4h（干蛋品1824h）。3.增菌移取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)1824h。同時(shí)，另取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37℃培養(yǎng)1824h。4.分離取上述增菌液接種于BS瓊脂或DHL瓊脂，進(jìn)行純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定。5.生化試驗(yàn)各種糖發(fā)酵試驗(yàn)，三糖鐵實(shí)驗(yàn)，尿素酶試驗(yàn)，做涂片染色鏡檢應(yīng)為G—陰性桿菌，必要時(shí)做氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為陰性。6.血清學(xué)試驗(yàn)1）抗原的準(zhǔn)備2）O抗原的鑒定3）鞭毛抗原的鑒定四、討論分析

1、如何了解前增菌在沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)中所起的作用？2、在腸桿菌科利用哪些鑒別方法可把沙門(mén)氏菌屬同腸桿菌科其它屬區(qū)別開(kāi)？3.沙門(mén)氏菌血清學(xué)鑒定應(yīng)遵循什么方法進(jìn)行？實(shí)驗(yàn)八金色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌的檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.認(rèn)識(shí)三種細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表現(xiàn)2.認(rèn)識(shí)三種細(xì)菌在菌體排列上的特點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.對(duì)三種細(xì)菌做革藍(lán)氏染色鏡檢,比較其形態(tài)學(xué)差異.2.Baird-Parker氏培養(yǎng)基的劃線(xiàn)培養(yǎng)金黃色葡萄球菌在Baird-Parker氏培養(yǎng)基上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為23mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周?chē)鸀橐粶啙釒В谕鈱佑幸煌该鲙aird-Parker氏培養(yǎng)基成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰5g瓊脂20gpH值7.3增菌劑的配法30%的卵黃鹽水50ml與除菌過(guò)濾的1%亞碲酸鉀溶液10ml混合，保存于冰箱內(nèi)。制作將Baird-Parker氏培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻至50℃，加入增菌劑5%，充分搖勻后，傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的，使用前在冰箱內(nèi)儲(chǔ)存不得超過(guò)48h?？梢愿膭?dòng)如下:30%的卵黃鹽水以及除菌過(guò)濾的1%亞碲酸鉀溶液保存于冰箱內(nèi)。將Baird-Parker氏培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻至50℃，直接加入30%的卵黃鹽水5%，1%亞碲酸鉀溶液1%。3.血漿凝固酶試驗(yàn)A．試管法1）吸取1:4稀釋的新鮮兔血漿0.5ml，放入小試管中，2）再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5ml，震蕩混勻，置37℃，每30min觀察一次，觀察6h，3）如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置，呈現(xiàn)凝塊者，為陽(yáng)性結(jié)果。玻片法通常用于檢測(cè)葡萄球菌胞壁上的凝集因子。取未稀釋的兔血漿及生理鹽水各一滴，分別放于潔凈玻片上，挑取試驗(yàn)菌，分別與鹽水及血漿混合，立即觀察，凝者判為陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)中采用玻片法進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)玻片法進(jìn)行凝集試驗(yàn),檢查金色葡萄球菌細(xì)胞壁上的凝集因子。再挑取菌落與鹽水混勻,使菌體成云霧狀最后加一滴血漿,使之與細(xì)菌混合先加數(shù)滴生理鹽水3.美藍(lán)牛乳試驗(yàn)原理在牛乳美藍(lán)培養(yǎng)基中，0.1%的美藍(lán)對(duì)溶血鏈球菌和鏈球菌有抑制作用，而糞腸球菌和乳球菌屬細(xì)菌不受影響，可在其中生長(zhǎng)，產(chǎn)生脫氫酶，使美藍(lán)變?yōu)榘咨?。方法將?xì)菌接在牛乳美藍(lán)培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)4天，如有生長(zhǎng)則培養(yǎng)基的藍(lán)色逐漸消失，即為美藍(lán)還原試驗(yàn)陽(yáng)性，相反顏色不變，即為陰性。試驗(yàn)菌株:腸球菌（+）；溶血鏈球菌（—）3.牛乳美藍(lán)培養(yǎng)基成分脫脂乳100ml1%美藍(lán)1~2ml混合后，分裝試管，115℃，20min滅菌，備用。4.腸球菌培養(yǎng)基（EC）將腸球菌在此培養(yǎng)基上做劃線(xiàn)分離成分胰蛋白胨2g酵母浸粉0.5g葡萄糖0.2g磷酸氫二鈉0.4g磷酸二氫鉀0.4g瓊脂2g水100mlpH7.4110℃,15min滅菌。冷至55℃時(shí),加入NaN340mgTTC10mg腸球菌在此培養(yǎng)基上呈紅色菌落。腸球菌鏈球菌乳球菌6.5%NaCL肉湯+--40%膽汁葡萄糖肉湯+-+pH9.6葡萄糖肉湯+--0.1%美藍(lán)牛乳+-+10℃生長(zhǎng)+-+45℃生長(zhǎng)+--耐熱60℃,30分鐘+-±D群抗原+--腸球菌、鏈球菌及乳球菌的區(qū)別三、討論分析1、腸球菌與鏈球菌在生物特性上的差異具體表現(xiàn)在哪些方面，以及腸球菌從原屬鏈球菌屬中獨(dú)立出的意義？2.金色葡萄球菌的毒力相關(guān)因子有哪些？實(shí)驗(yàn)八產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌的檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼J(rèn)識(shí)產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌在各自選擇性培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)及形態(tài)特征,掌握兩種細(xì)菌的檢驗(yàn)方法。二、實(shí)驗(yàn)方法

1.卵磷脂酶試驗(yàn)1)將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于卵黃瓊脂平板，37℃厭氧培養(yǎng)24h，產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵黃中的卵磷脂，菌落周?chē)a(chǎn)生乳白色的渾濁帶。2)蠟樣芽孢桿菌同樣為卵磷脂酶試驗(yàn)陽(yáng)性。2.SPS瓊脂培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌在此培養(yǎng)基上為黑色菌落。可作為記數(shù)用。亞硫酸鹽-多黏菌素-磺胺嘧啶瓊脂(SPS)胰酶消化酪蛋白胨15g酵母膏10g檸檬酸鐵銨0.7~1.0g瓊脂15g蒸餾水1000ml10%亞硫酸鈉水溶液5ml0.12%多黏菌素B硫酸鹽水溶液10ml1.2%磺胺嘧啶鈉水溶液10mlpH7.43.甘露醇-卵黃-多黏菌素瓊脂（MYP）該培養(yǎng)基用于蠟樣芽孢桿菌的選擇性培養(yǎng)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上的菌落為粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇）,周?chē)蟹奂t色的暈（表示產(chǎn)生卵磷脂酶）。甘露醇-卵黃-多黏菌素瓊脂（MYP）蛋白胨10g牛肉膏1g甘露醇10g氯化鈉10g瓊脂15g蒸餾水1000ml0.2%酚紅溶液13ml50%卵黃液50ml多黏菌素B100單位/mlpH7.4

4.硝酸鹽還原試驗(yàn)

1）原理某些細(xì)菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,亞硝酸鹽與試劑中的醋酸作用,生成亞硝酸,亞硝酸與對(duì)氨基苯磺酸作用,生成對(duì)重氮苯磺酸,再與萘胺結(jié)合,生成N--萘胺偶氮苯磺酸,呈紅色反應(yīng)。2）試劑甲液對(duì)氨基苯磺酸0.8g；5N醋酸100ml；乙液萘胺0.5g；5N醋酸100ml。3）方法取細(xì)菌接種到硝酸鹽培養(yǎng)基上,在37℃培養(yǎng)14天,加入甲液和乙液各數(shù)滴,如出現(xiàn)紅色者即為陽(yáng)性反應(yīng)。還原能力強(qiáng)的細(xì)菌,可把硝酸鹽全部還原成氮,出現(xiàn)假陰性。4）產(chǎn)氣莢膜梭菌和蠟樣芽孢桿菌均為陽(yáng)性。

硝酸鹽培養(yǎng)基

成分:蛋白胨5gKNO30.2g蒸餾水1000mlpH7.45.產(chǎn)氣莢膜梭菌的暴烈發(fā)酵試驗(yàn)方法:將產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于含鐵的牛乳培養(yǎng)基，因能夠發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生大量氣體，并使牛奶酸凝。含鐵牛乳培養(yǎng)基新鮮牛奶1000ml硫酸亞鐵1g121℃，15min滅菌6.染色鏡檢涂片制作和固定初染:固定好涂片、抹片，草酸銨結(jié)晶紫溶液染色2-3min，水洗。媒染:革蘭氏碘液2-3min，水洗。脫色:95％酒精，脫色時(shí)間根據(jù)涂抹面的厚度靈活掌握，多在30s左右，最長(zhǎng)不宜超過(guò)1min，水洗。復(fù)染:沙黃水溶液染色2-3min，水洗。吸干或自然干燥。鏡檢:G＋菌呈藍(lán)紫色，G