第13章-RNA生物合成

第十三章

RNA的生物合成（轉(zhuǎn)錄）

transcription轉(zhuǎn)錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄RNADNA

參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)底物(substrate):

NTP(ATP、UTP、GTP、CTP)模板(template)

:DNA酶:依賴DNA的

RNA聚合酶,

簡(jiǎn)稱RNA聚合酶

(RNApolymerase,RNA-pol)其他：蛋白質(zhì)因子、Mg2+、Mn2+第一節(jié)RNA合成中的模板和酶一、轉(zhuǎn)錄模板1結(jié)構(gòu)基因(structuralgene):

能轉(zhuǎn)錄出RNA(mRNA、rRNA和tRNA)的DNA區(qū)段。2不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription):DNA的一些區(qū)段可以轉(zhuǎn)錄出RNA，另一些不能轉(zhuǎn)錄出RNA。在DNA雙鏈上，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄區(qū)不總是在同一單鏈上。5’3’5’3’2.方框內(nèi)的DNA區(qū)段為結(jié)構(gòu)基因?yàn)槟０彐?templestrand)

按堿基配對(duì)規(guī)律指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄生成RNA1.箭頭示轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及轉(zhuǎn)錄方向4.為編碼鏈(codingstrand)5’…GCAGTACATGTC…3’3’…cgtcatgtacag…5’DNA5’…GCAGUACAUGUC…3’mRNAN…AlaValHisVal…C多肽鏈轉(zhuǎn)錄翻譯編碼鏈模板鏈*編碼鏈又稱為有意義鏈，模板鏈又稱為反義鏈

RNA聚合酶(DNAdependentRNApolymerase,RNApol)

,全稱依賴DNA的RNA聚合酶(DDRP),也稱轉(zhuǎn)錄酶（transcriptase)

。原核生物（E.Coli）RNApol

由α2ββ′σ

共5個(gè)亞基組成。α

2ββ′核心酶(coreenzyme)二、RNA聚合酶α2ββ′

σ全酶(holoenzyme)σ亞基+σ全酶(holoenzyme)

核心酶(coreenzyme)

（一）原核生物的RNA聚合酶β

聚合酶功能σ辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)β′結(jié)合DNA模板（開(kāi)鏈）大腸桿菌RNA聚合酶亞基的功能α

決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄類(lèi)型主要功能被利福平結(jié)合而抑制ααββ’TTGACATATAAT-35原核生物的RNA聚合酶及其在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合σ-10σ70(典型)σ32（應(yīng)激）Heatshockprotein(Hsp)熱激蛋白（二）真核生物的RNA聚合酶真核生物RNApol的種類(lèi)與功能種類(lèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)鵝膏蕈堿的敏感性

RNApolⅠ

RNApolⅡ

RNApol

Ⅲ45S是5.8S、18S和28SrRNA的前體hnRNA是mRNA的前體45SrRNA

不敏感hnRNA

極敏感tRNA、5S-rRNA中度敏感和snRNA

小分子核內(nèi)核糖核酸(smallnuclearRNA，snRNA)

真核生物的RNA聚合酶亞基的功能50kD中亞基1α亞基小亞基Ⅰ(10)Ⅱ(7)

Ⅲ(11)

σ亞基(識(shí)別起始點(diǎn))類(lèi)型數(shù)目/每個(gè)酶對(duì)應(yīng)于原核功能＞100kD大亞基2β和β′亞基(催化)★3種pol

的大亞基C末端aa序列均為(YSPTSPS)n;★

n=20-60,與種屬有關(guān),稱羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD);★含帶羥基的Y(酪)\S(絲)\T(蘇),可被磷酸化;★

polⅡ的磷酸化在從轉(zhuǎn)錄起始過(guò)渡到延長(zhǎng)時(shí)重要。PS1S2S3啟動(dòng)子OPromoter調(diào)控序列結(jié)構(gòu)基因

操縱子

結(jié)合RNA聚合酶表達(dá)功能蛋白?I三、RNA聚合酶與模板的辨認(rèn)結(jié)合操縱子（operon）:

原核生物的轉(zhuǎn)錄單位RNA聚合酶保護(hù)法RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因終止點(diǎn)-10轉(zhuǎn)錄開(kāi)始+1-35模板與酶的辨認(rèn)結(jié)合TTGACATATAAT（Pribnowbox）RNApol辨認(rèn)結(jié)合區(qū)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)共有序列第二節(jié)RNA生物合成(轉(zhuǎn)錄)過(guò)程起始

(initiation)

延長(zhǎng)

(elongation)

終止

(termination)（一）原核生物的轉(zhuǎn)錄起始σ亞基辨認(rèn)-35區(qū)RNApol

全酶移向-10區(qū)合成第一個(gè)磷酸二酯鍵5’-pppGpN-OH-3’轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物RNApol(α2ββ′σ)—DNA—pppGpN-OHσ亞基脫落(進(jìn)入延長(zhǎng)階段)（結(jié)合松弛）（結(jié)合較緊密）轉(zhuǎn)錄起始不需引物！pppG-OH

+pppN-OHγβαRNApol5′-pppGpN-OH-3′+PPi1.

亞基脫落，RNA-pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長(zhǎng)。(NMP)n

+

NTP

(NMP)n+1+PPi（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄空泡(酶-DNA-RNA形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物）RNA穩(wěn)定性：GC>AT>AUtranscriptionbubble

RNApol（核心酶）DNA原核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)與蛋白質(zhì)合成同 時(shí)進(jìn)行

多個(gè)轉(zhuǎn)錄同時(shí)進(jìn)行原核生物轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)：多聚核糖體(polysome)

（三）轉(zhuǎn)錄終止1.依賴Rho（ρ）因子的轉(zhuǎn)錄終止2.非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止ρ因子1.識(shí)別結(jié)合富含C的RNA鏈功能2.ATPase活性3.解螺旋酶活性ρ因子+ATP5′3′Polymerase富含C1.依賴Rho（ρ）因子的轉(zhuǎn)錄終止RNApol5′3′RNApol失活ρ因子解螺旋，使RNA脫落RNA轉(zhuǎn)錄后，形成特殊的結(jié)構(gòu)，以終止轉(zhuǎn)錄。2.非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止特點(diǎn)：1.RNA單鏈內(nèi)部接近終止區(qū)域有富含G-C配對(duì)區(qū)，形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。2.在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的下游有polyU結(jié)構(gòu)。莖環(huán)（stemloop）或發(fā)夾（hairpin）結(jié)構(gòu)UUGCAGCCUGAGAAAUCAGGCUGAUGG…5′3′…5′3′自發(fā)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（E.coli

rpl-L3’末端）第1個(gè)莖環(huán)AUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUU5′3′UUUU……5′3′自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)第2個(gè)莖環(huán)UUUU………..5′3′1.莖環(huán)結(jié)構(gòu)改變RNApol的結(jié)構(gòu)，使其失活2.莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解體，polyU加速這一過(guò)程。GpN結(jié)構(gòu)基因RNApol識(shí)別結(jié)合生成起始復(fù)合物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄終止啟動(dòng)子終止點(diǎn)pppGpppG原核生物的轉(zhuǎn)錄過(guò)程σ二、真核生物的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-25bp區(qū)段多數(shù)有共同的TATA序列，稱為Hogness盒或TATA盒。不同物種、不同細(xì)胞、不同的基因，可以有不同的上游DNA序列，但都可統(tǒng)稱為順式作用元件(cis-actingelement)。（一）轉(zhuǎn)錄起始1.轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游序列(upstreamsquences)與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的DNA非編碼序列，統(tǒng)稱為順式作用元件。真正轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)GCGC-CAAT-TATA..ATGAATAAA修飾點(diǎn)外顯子內(nèi)含子翻譯起始轉(zhuǎn)錄起始TATA盒(Hognessbox)CAAT盒GC盒增強(qiáng)子切離加尾真核生物RNApolⅡ轉(zhuǎn)錄的基因翻譯終止能直接或間接辨認(rèn)、結(jié)合順式作用元件，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一類(lèi)蛋白質(zhì)因子。反式作用因子中，直接或間接結(jié)合RNA聚合酶的蛋白質(zhì)因子。2.反式作用因子(trans-actingfactor)轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionalfactor,TF)參與RNA-polⅡ轉(zhuǎn)錄的TFⅡ轉(zhuǎn)錄因子功能TFⅡA穩(wěn)定TFⅡD-DNA復(fù)合物TFⅡB促進(jìn)polⅡ結(jié)合TFⅡDTBP結(jié)合TATA盒TAF輔助TBP-DNA結(jié)合TFⅡEATPaseTFⅡF解螺旋酶TFⅡH蛋白激酶活性,使CTD磷酸化TAF：TBPassociatedfactorsTBP輔因子TBP：TATAbindingproteinTATA結(jié)合蛋白3.

轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結(jié)合，而需依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。ⅡAⅡB由RNA-Pol

Ⅱ催化轉(zhuǎn)錄的PICPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復(fù)合物TATAPOL-ⅡTFⅡFⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化ⅡAⅡBTBPTAFTATA拼板理論(piecingtheory)一個(gè)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄需要3至5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子之間不同方案組合，生成有活性、專(zhuān)一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對(duì)性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。

按不同組合，人類(lèi)約３.５萬(wàn)個(gè)基因，估計(jì)需轉(zhuǎn)錄因子３００余個(gè)即可。（二）轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)*polⅡ大亞基CTD被TFⅡH磷酸化才能離開(kāi)起動(dòng)子區(qū)域并進(jìn)入延長(zhǎng)階段。*真核生物轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程與原核生物大致相似，但沒(méi)有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。*

RNA-pol前移處處都遇上核小體。

*轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)過(guò)程中隨RNApol前移，可以觀察到核小體移位或解聚現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)中的核小體移位和解聚RNA-Pol核小體轉(zhuǎn)錄方向移位RNA-PolRNA-Pol解聚及彎曲（三）真核生物的轉(zhuǎn)錄終止AAUAAAGUGUGUGAATAAAGTGTGT3′processing（核酸內(nèi)切酶）—AAUAAA—Poly(A)NucleaseHelicasehnRNA5’Release轉(zhuǎn)錄終止修飾點(diǎn)pausepolII（一）真核生物mRNA的剪接

1.hnRNA

(heterogeneousnuclearRNA)富含Ｕ不均一核RNA，核內(nèi)未被剪接的有內(nèi)含子的mRNA前體。2.

snRNA

(smallnuclearRNA)種類(lèi)：U1，U2，U3，U4，U5，U6等。幾個(gè)重要概念第三節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄后加工一、真核生物新生mRNA的剪接和修飾核內(nèi)小RNAsnRNP（小分子核糖核蛋白體）

(RNA剪接的場(chǎng)所)

核內(nèi)蛋白質(zhì)snRNA4.斷裂基因(splitgene)真核生物的結(jié)構(gòu)基因中，外顯子被內(nèi)含子間隔開(kāi)，但連續(xù)鑲嵌，為一個(gè)連續(xù)完整的蛋白質(zhì)編碼。這種基因稱為斷裂基因。3.外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron)真核生物結(jié)構(gòu)基因中的編碼序列，稱為外顯子，非編碼序列稱為內(nèi)含子。SPreBCA成熟的mRNA5′——3′SPreBCCAhnRNA胰島素基因斷裂基因的概念內(nèi)含子的分類(lèi)

根據(jù)基因的類(lèi)型和剪接的方式，通常把內(nèi)含子分為4類(lèi)。I：主要存在于線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發(fā)現(xiàn)于線粒體、葉綠體，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA；III：是常見(jiàn)的形成套索結(jié)構(gòu)后剪接，大多數(shù)mRNA基因有此類(lèi)內(nèi)含子；IV：是tRNA基因及其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的內(nèi)含子，剪接過(guò)程需酶及ATP。內(nèi)含子的功能，兩種觀點(diǎn)：1.內(nèi)含子是在進(jìn)化中出現(xiàn)和消失的，是進(jìn)化過(guò)程中的遺跡，無(wú)實(shí)質(zhì)性意義。2.內(nèi)含子影響剪切效率及剪切位置，在基因表達(dá)中有調(diào)控功能。真核生物mRNA的剪接過(guò)程剪接體(splicesome)識(shí)別結(jié)合hnRNA內(nèi)含子5’及3’區(qū)域2.形成套索RNA(lariatRNA)，外顯子靠近3.兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，切去內(nèi)含子，連接外顯子（剪接體是snRNP與hnRNA結(jié)合）外顯子內(nèi)含子DNAmRNA轉(zhuǎn)錄形成套索RNA，外顯子靠近剪接體去除套索RNA，外顯子連接成熟mRNACAUUCAUAUGAUGU外顯子1外顯子2GUAAGUAUACUACAAG5’3’內(nèi)含子分支點(diǎn)U1U2剪接體形成套索RNA外顯子靠近GpUE1E2UpAI1U-OHE1GpUE2pAI1pG-OH第一步轉(zhuǎn)酯第二步轉(zhuǎn)酯intronexon1exon2UpUE1G-OHE2pAI1ppG\pppG（二）mRNA編輯☆mRNAediting是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入、刪除或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象?！钍狗g生成的蛋白質(zhì)的氨基酸組成，不同于基因序列中的編碼信息?！钍沟靡粋€(gè)基因序列有可能產(chǎn)生幾種不同的蛋白質(zhì)，這可能是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的、更經(jīng)濟(jì)有效地?cái)U(kuò)展原有遺傳信息的機(jī)制。☆基因的編碼序列經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄后加工，是可有多用途分化的，因此也稱為分化加工(differentialRNAprocessing)。圖13-38

分化加工(differentialRNAprocessing)513kDApoB100ApoB485′GpppG…鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)移酶5′…m7GpppG…RNA甲基轉(zhuǎn)移酶磷酸酶PPi5′pG…5′pppG…RNAGTPSAMSAHhnRNA+nATPpolyA聚合酶Mg2+RNA-(A)n+nPPi加帽加尾Pi在hnRNA

5’端加上m7GpppG--在hnRNA

3’端加上polyA（三）mRNA首、尾的修飾加帽加尾的意義：1.蛋白質(zhì)翻譯起始所需2.mRNA穩(wěn)定性所需3.polyA尾與mRNA轉(zhuǎn)位、作為翻譯模板及其穩(wěn)定有關(guān)G二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工DHU—loopT

looptRNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNApolIIIIntronExonAnticodonloop二氫尿嘧啶(反密碼子環(huán))加工

tRNA的初級(jí)產(chǎn)物成熟tRNA內(nèi)切酶RNaseP連接酶轉(zhuǎn)移酶氨基酸臂CCA—OH的生成：核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化堿基修飾（2）還原反應(yīng)如：U

DHU（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：U

ψ（4）脫氨反應(yīng)如：A

I（1）（1）（3）（2）（4）如：A

mA

（1）甲基化

G

mG

三、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工真核生物rRNA的基因?qū)儆谪S富基因族的DNA序列，也即高度重復(fù)的串聯(lián)基因(tandemgene)，或稱為高度重復(fù)序列DNA。45srDNA45srRNA18s，5.8s，28s

rRNARNApolI45srDNA間隔區(qū)(spacer)內(nèi)含子外顯子5srDNA5srRNARNApolIII轉(zhuǎn)錄(RNApolI)45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA內(nèi)含子內(nèi)含子28S5.8S18S最早發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)rRNA的剪接不需要任何蛋白質(zhì)參與即可發(fā)生，說(shuō)明rRNA本身就有酶的催化作用。概念：具有酶促活性(催化功能)的RNA。四、核酶(ribozyme)核酶發(fā)現(xiàn)的意義：1.對(duì)傳統(tǒng)酶學(xué)提出挑戰(zhàn)2.生物進(jìn)化中的意義3.潛在的基因治療的有力工具切割點(diǎn)槌頭型(hammerheadstructure)核酶的結(jié)構(gòu)GU

GNNNNNNNNNN

3'5'

N

C

A

A

NNNA

NNNA

C

N

A

N

C

U

G1.至少有3個(gè)莖2.1—3個(gè)環(huán)3.至少有13個(gè)一致性序列切割點(diǎn)切割點(diǎn)XXXNXXX5’