結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義

結(jié)核分枝桿菌試驗

室檢測方法

結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第1頁主要內(nèi)容一、結(jié)核桿菌病原學(xué)基礎(chǔ)

二、結(jié)合分支桿菌全球流行情況三、結(jié)核桿菌試驗室檢測方法及臨床應(yīng)用結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第2頁一、結(jié)核病病原學(xué)基礎(chǔ)結(jié)核桿菌屬:一類細(xì)長略帶彎曲，有時呈分枝狀桿菌，本屬細(xì)菌多含有抗酸性，又稱抗酸桿菌（acid-fastbacillus），細(xì)菌體內(nèi)含有分枝菌酸，細(xì)胞壁含有大量脂類，這與分枝桿菌染色性、抵抗力和致病性等親密相關(guān)。本屬細(xì)菌已經(jīng)被判定有70各種，可分為三大類:結(jié)核分枝桿菌、非經(jīng)典分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌；按生長速度可分為三類，即遲緩生長菌、快速生長菌和不能培養(yǎng)菌三種類型結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第3頁結(jié)核分枝桿菌群結(jié)核分枝桿菌,是人和動物結(jié)核病病原體,包含人結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支桿菌（M.bovis）、非洲分支桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti）,前三種對人類治病,其中人型結(jié)核分枝桿菌感染發(fā)病率最高。結(jié)核分枝桿菌屬于遲緩生長分支桿菌結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第4頁結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第5頁及時準(zhǔn)確診療結(jié)核病,有效地控制傳染源,對預(yù)防結(jié)核病至關(guān)主要。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第6頁結(jié)核病試驗室檢查細(xì)菌學(xué)檢驗免疫學(xué)檢驗分子生物學(xué)檢驗涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種判定結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第7頁最原始最基礎(chǔ)檢測方法涂片染色鏡檢結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第8頁抗酸染色原理分枝桿菌細(xì)胞壁內(nèi)含有大量脂質(zhì)。包圍在肽聚糖外面,所以分支桿菌普通不易著色,需要經(jīng)過加熱或是延長染色時間來促使其著色。但分支桿菌中分支菌酸與染料結(jié)合后,就極難被酸性脫色劑脫色,故名抗酸染色。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第9頁涂片染色鏡檢臨床價值

適合用于各種標(biāo)本；操作簡便,價格低廉。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第10頁涂片鏡檢臨床應(yīng)用

一、確診涂陽結(jié)核病及開放性結(jié)核2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+影像學(xué)檢驗符合活動性肺結(jié)核表現(xiàn)。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第11頁涂片鏡檢臨床應(yīng)用二、肺結(jié)核治療評定主要依據(jù)之一治愈:涂陽肺結(jié)核患者完成要求療程，連續(xù)2次涂片結(jié)果陰性，其中1次是治療末涂片。治療失敗:新涂陽患者治療第5個月末或療程結(jié)束時，痰涂片檢驗陽性，涂陰肺結(jié)核患者治療過程中任何1次痰菌檢驗陽性，均為治療失敗。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第12頁缺點:不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分支桿菌不能區(qū)分死菌跟活菌。結(jié)核桿菌暴露于異煙肼時,一些條件會失去抗酸性,出現(xiàn)假陰性。檢測靈敏度較低（104-105個細(xì)菌/毫升）。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第13頁分枝桿菌分離培養(yǎng)結(jié)核菌培養(yǎng)仍是當(dāng)前診療結(jié)核病金標(biāo)準(zhǔn).尤其是藥敏試驗結(jié)果在指導(dǎo)臨床用藥及耐藥性檢測等方面含有主要作用,是判定是否為活菌可靠方法.傳統(tǒng)固態(tài)培養(yǎng)法需要4～6周才能檢測到結(jié)核菌生長.而且陽性率也只有30％-40％；特異性差.各種分枝桿菌均可生長。要確定是否為結(jié)核菌.需結(jié)合分枝桿菌菌種判定和藥品敏感性試驗?？焖倥囵B(yǎng)法:檢測細(xì)菌生長過程中代謝產(chǎn)生CO2或消耗O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等。快速培養(yǎng)法陽性匯報時間大約是1—3周左右，比傳統(tǒng)固態(tài)培養(yǎng)法快，不過儀器價格太昂貴。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第14頁確診結(jié)核病1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性即可確診。痰涂片陰性,肺部影像學(xué)檢驗符合活動性肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結(jié)核菌培養(yǎng)臨床價值結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第15頁用于耐多藥結(jié)核療效判定治愈:（1）患者完成療程，且在療程后12個月，最少最終5次痰培養(yǎng)（每次間隔最少30天）連續(xù)陰性。（2）如出現(xiàn)1次痰培養(yǎng)陽性，其后痰培養(yǎng)（間隔最少30天）最少連續(xù)3次陰性。失敗:治療最終12個月，5次痰培養(yǎng)中有兩次或兩次以上陽性；或者在最終3次，培養(yǎng)中有任何一次是陽性。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第16頁分離培養(yǎng)優(yōu)點敏感性較直接涂片法高,理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高,能夠從菌落生長速度、色素產(chǎn)生初步判斷非結(jié)核分枝桿菌；分離出含有活力純培養(yǎng)物,為深入藥敏試驗提供基礎(chǔ)。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第17頁分離培養(yǎng)缺點需時長,依據(jù)接種量大小,普通2-8周才能得到肉眼可見菌落。結(jié)果受標(biāo)本保留運輸時間、培養(yǎng)基成份和質(zhì)量、前處理方法等影響,操作較直接涂片法復(fù)雜,需經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn),對試驗室要求也是較高。成本是直接涂片法7-8倍。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第18頁結(jié)核病試驗室檢查細(xì)菌學(xué)檢驗免疫學(xué)檢驗分子生物學(xué)檢驗涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種判定體液免疫學(xué)檢驗細(xì)胞免疫學(xué)檢驗結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第19頁體液免疫學(xué)檢驗（血清學(xué)檢驗）結(jié)核抗體測定結(jié)核抗原測定循環(huán)免疫復(fù)合物測定

結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第20頁血清學(xué)診療血清學(xué)診療技術(shù)優(yōu)勢:是一個對疾病進(jìn)行早期診療理想方法。無需活細(xì)胞培養(yǎng)和特殊儀器設(shè)備操作簡便結(jié)果顯示快速當(dāng)前用于血清學(xué)診療主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(WesternBlotting)等等結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第21頁年WHO正式公告:因為當(dāng)前商業(yè)血清學(xué)試劑在結(jié)核檢測中存在較大差異，且檢測結(jié)果很高百分比假陽性和假陰性，所以不提議使用血清學(xué)方法作為結(jié)核桿菌診療試驗1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis./publications//9789241502054_eng.pdf血清學(xué)檢測評價原因:因為所用測定方法、使用試劑種類或抗原、抗體不一樣等，造成測定結(jié)果差異較大，而且缺乏可比性。WHO對來自不一樣國家19種試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行評定，結(jié)果表明:與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測靈敏度為1%~60%，特異度為53~99%1。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第22頁結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)檢驗結(jié)核菌素皮膚試驗蛋白水平分子診療:γ-干擾素釋放試驗（IGRA)結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第23頁遲發(fā)型細(xì)胞超敏反應(yīng)1）方法:1:OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側(cè)中部皮內(nèi)注射，48～72h測量皮膚硬結(jié)直徑。結(jié)核菌素試驗（PPD試驗）結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第24頁2）判斷標(biāo)準(zhǔn):陰性≤4mm弱陽性5-9mm陽性10-19mm，強陽性≥20mm或局部出現(xiàn)水泡與壞死結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第25頁3)結(jié)核菌素試驗意義陰性:無結(jié)核菌感染；不能排除結(jié)核感染。陽性:曾有結(jié)核感染，并不一定現(xiàn)在患病。強陽性:活動性結(jié)核病可能

A、變態(tài)反應(yīng)還未建立；

B.免疫抑制如應(yīng)用皮質(zhì)激素或營養(yǎng)不良等

結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第26頁PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有,其結(jié)果受到卡介苗接種及其它分枝桿菌感染影響,特異性較差。當(dāng)出現(xiàn)免疫功效低下時可出現(xiàn)假陰性結(jié)果,敏感性低。免疫力正常陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結(jié)核變態(tài)反應(yīng)、淋巴結(jié)核強陽性多。經(jīng)濟、簡便,能夠用于流行病學(xué)大規(guī)模篩查和普查,但存在著顯著缺點。PPD試驗臨床價值結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第27頁結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌各種細(xì)胞因子（IFN-γ）。所以，檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者診療。因為效應(yīng)T細(xì)胞存活時間很短，而且含有特異性，所以能夠作為機體是否正處于被感染指標(biāo)，不論是否有臨床癥狀。基于IGRA原理產(chǎn)品當(dāng)前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國結(jié)核診療指南中。當(dāng)前應(yīng)用進(jìn)口IGRA主要有兩種商品化試劑:1）澳大利亞Cellestis企業(yè)QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英國OxfordImmunotec企業(yè)T-SPOT.TB蛋白水平分子診療:γ-干擾素釋放試驗（IGRA)結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第28頁T-SPOT?.TB原理T-SPOT?.TB是以擁有專利特異抗原（ESAT-6/CFP-10），經(jīng)過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）檢測受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而判斷當(dāng)前該受試者是否感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）新方法。結(jié)核桿菌特異抗原:早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第29頁T-SPOT?.TB臨床性能指標(biāo)特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng)美國FDA數(shù)據(jù):特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù):特異性94.1%(478/508)靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高檢出率美國FDA數(shù)據(jù):靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù):靈敏度95.3%(624/655)結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第30頁試驗結(jié)果解釋陰性結(jié)果提醒患者體內(nèi)不存在針對結(jié)核桿菌特異效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果:①感染階段不一樣；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功效不全患者陽性結(jié)果提醒患者體內(nèi)存在針對結(jié)核桿菌特異效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。不過否是活動性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測指標(biāo)綜合判斷。假陽性結(jié)果:①4種環(huán)境分枝桿菌感染時:M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第31頁方法學(xué)優(yōu)點檢測特異性提升幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引發(fā)“假陽性”,防止了臨床無效用藥檢測靈敏度提升有利于臨床對結(jié)核病早發(fā)覺、早治療,防止了疾病傳輸與擴散快速48小時出結(jié)果結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第32頁方法學(xué)局限不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染不能夠提醒臨床患者病變部位,需要結(jié)合臨床判斷當(dāng)前還不能夠依據(jù)斑點數(shù)量多少來判斷患者是活動性結(jié)核病或是潛伏感染者不適適用于結(jié)核病患者治療療效監(jiān)測檢測收費高（600-700元/次）結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第33頁體外r-干擾素釋放試驗

活動性結(jié)核病經(jīng)過有效抗結(jié)核治療后,結(jié)核桿菌載量下降,效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量會隨之降低,所以理論上IGRA結(jié)果應(yīng)從陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?但臨床實踐中發(fā)覺IGRA結(jié)果轉(zhuǎn)陰率非常低。年發(fā)表一篇meta分析中指出,T-SPOT.TB在結(jié)核病患者抗結(jié)核治療后轉(zhuǎn)陰率為5.71%-13.93%,說明IGRA在評價抗結(jié)核治療方面作用是有限。

ChiappiniE,FossiF,BonsignoriF,etal.Utilityofinterferon-γreleaseassayresultstomonitoranti-tuberculartreatmentinadultsandchildren.ClinTher,,34:1041-1048.IGRA在評價抗結(jié)核治療中作用是有限結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第34頁結(jié)核病試驗室檢查細(xì)菌學(xué)檢驗免疫學(xué)檢驗分子生物學(xué)檢驗涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種判定體液免疫學(xué)診療細(xì)胞免疫學(xué)診療聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）DNA測序DNA探針技術(shù)基因芯片技術(shù)結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第35頁分子生物學(xué)檢測方法近年來核酸擴增技術(shù)和雜交分析技術(shù)發(fā)展,為分枝桿菌檢測、判定和藥敏試驗提供了極大方便,可將診療時間從幾周降低到幾天甚至是幾個小時。研究、應(yīng)用報道較多結(jié)核病基因診療技術(shù)主要包含聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、DNA序列測定、基因芯片、基因分型等。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第36頁實時熒光PCR技術(shù)本試驗室所使用結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）采取單管單人份分裝技術(shù),操作過程非常簡便；并引入熒光檢測技術(shù),簡化了檢測步驟,而且整個擴增及擴增后檢測都無需打開擴增管蓋,從根本上克服了PCR遺留污染。熒光探針PCR檢測技術(shù)綜合了PCR擴增高敏感性、探針雜交高特異性及熒光能量轉(zhuǎn)移實時跟蹤特征,使檢測準(zhǔn)確性大大提升,并可充分確保檢測穩(wěn)定性及重復(fù)性。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第37頁結(jié)核桿菌PCR檢測臨床意義1.在痰菌陰性結(jié)核快速診療有主要臨床應(yīng)用價值。在臨床工作中,痰菌陰性,經(jīng)臨床綜合分析后診療為肺結(jié)核患者,約占肺結(jié)核患者60%-70%。有報道指出痰菌陰性肺結(jié)核患者,假如未經(jīng)抗結(jié)核治療,經(jīng)過1-3年隨訪,將有40%-60%患者發(fā)展為菌陽甚至更經(jīng)典肺結(jié)核。所以取得病原學(xué)診療至關(guān)主要結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第38頁結(jié)核桿菌PCR檢測臨床意義年發(fā)表在中國防癆雜志中一篇文章研究指出在476例菌陰肺結(jié)核病患者中,PCR法檢出116例陽性,檢測靈敏度為24.4%而菌陽肺結(jié)核患者檢測靈敏度為97.0%結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第39頁結(jié)核桿菌PCR檢測臨床意義2.PCR法能夠作為臨床痰涂片和痰培養(yǎng)補充，為臨床診療和治療提供幫助涂片陽性并不能區(qū)分是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌，這二者治療是有很大差異，NTM對于慣用抗結(jié)核藥經(jīng)常都是無效，所以對于涂片陽性標(biāo)本，很有必要在在做MTB-DNA檢測，深入確認(rèn)是否是真MTB感染。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第40頁結(jié)核桿菌PCR檢測臨床意義3.可作為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結(jié)核早期診療一個可靠指標(biāo)。118例疑似結(jié)核病患者,其中關(guān)節(jié)炎患者52例,泌尿系感染患者66例,應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)分別檢測患者關(guān)節(jié)腔積液和尿液中TB-DNA,并與抗酸染色法檢出率比較。結(jié)果52例關(guān)節(jié)炎患者中,確診結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者36例,TB-DNA陽性22例,22例全部為確診病例,陽性率61.1%?？顾崛旧栃灾挥?例,陽性率5.6%;66例泌尿系統(tǒng)疾病患者中,確診泌尿系結(jié)核患者52例,TB-DNA陽性32例,32例全部為確診病例,陽性率為61.5%,抗酸染色陽性只有4例,陽性率7.7%。結(jié)論應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)檢測患者關(guān)節(jié)腔積液和尿液中TB-DNA,含有高度敏感性和特異性,可作為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎和泌尿系統(tǒng)結(jié)核早期診療一個可靠指標(biāo)?！赌臧l(fā)表在中國防癆》雜志結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第41頁結(jié)核桿菌PCR檢測臨床意義4.PCR用于臨床療效觀察比涂片、培養(yǎng)實用，對預(yù)計有可能復(fù)發(fā)病例有一定幫助有些耐藥菌或患者經(jīng)化療后痰排菌可能轉(zhuǎn)化為Ｌ型結(jié)核分枝桿菌，抗酸染色不能有效檢測，而ＰＣＲ檢測細(xì)菌ＤＮＡ，不受其表型改變影響，所以ＰＣＲ較抗酸染色法對Ｍｔｂ有更強檢出能力，能更有效地發(fā)覺傳染源、降低漏診率，是早期診療肺結(jié)核比很好指標(biāo)。L型結(jié)核分支桿菌是形成慢性傳染源主要原因,也是結(jié)核病惡化、復(fù)發(fā)細(xì)菌學(xué)根源。所以對年老體弱、合并有其它機體疾病、痰中含菌量多、肺部結(jié)核病變廣泛、有空洞存在、化療期滿、微生物學(xué)檢驗(涂片加培養(yǎng))陰轉(zhuǎn)但PCR仍連續(xù)陽性患者,應(yīng)采取繼續(xù)親密觀察,或同時考慮更改治療方案或延長治療時間及隨訪時間等做法。結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第42頁結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義第43頁美國CDC提議:在同時取得核酸檢測和涂片結(jié)果后，

依據(jù)其結(jié)果不一樣可分為4種情況1.對于核酸檢測和抗酸桿菌涂片結(jié)果均為陽性患者,需高度懷疑結(jié)核病,