DB21T-禽克雷伯菌病診斷技術(shù)規(guī)范

21TechnicalspecificationfordiagnosisofKlebsielladiseaseforpoultryⅠ請(qǐng)注意，本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)錦州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心瓦房店市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心劉廣旭1禽克雷伯菌病診斷技術(shù)規(guī)范范圍本文件適用于禽克雷伯菌病的診斷、檢疫和流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。但是，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究使用這些文件的最新版本。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范、NY/T1948-2010獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求通則。符號(hào)和縮略語(yǔ)下列符號(hào)和縮略語(yǔ)適用于本文件。符號(hào)縮略語(yǔ)英文縮寫中文全稱英文縮寫中文全稱NA營(yíng)養(yǎng)瓊脂16SrRNA16S核糖體RNA基因MAC麥康凱瓊脂DNA脫氧核糖核酸SS沙門志賀菌屬瓊脂PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)MR甲基紅TaqMix擴(kuò)增預(yù)混液VP乙酰甲基甲醇試驗(yàn)ddH2O雙重去離子水TSI三糖鐵瓊脂khe肺炎克雷伯氏菌特異性基因H2S硫化氫C枸櫞酸鹽診斷依據(jù)流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀及剖檢變化等做出初步診斷，確診需做病原學(xué)鑒定。4.1流行病學(xué)4.1.1在發(fā)病前有接觸感染禽克雷伯菌的病禽或帶菌禽；4.1.2主要為20日齡以內(nèi)的幼禽發(fā)病。幼年禽發(fā)病率和死亡率較高，成年禽類少見(jiàn)發(fā)??；4.1.3發(fā)病前有季節(jié)交替、環(huán)境溫度突變、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素。4.2臨床癥狀及剖檢變化4.2.1臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁，體溫升高，呼吸困難。4.2.2剖檢變化剖檢以纖維素性肺炎變化為主。患病幼雛皮下出血，氣管黏膜出血，心外膜增厚，肺淤血、水腫、壞死、切面有紅色泡沫樣液體流出，胸腔有滲出液混有膠凍樣物，肝臟壞死、肝包膜增厚、嚴(yán)重的表面覆有一層纖維素性偽膜，脾臟腫大充血，腎臟腫大有出血斑點(diǎn)，腸道充血出血明顯，盲腸積糞，腦實(shí)質(zhì)出血。4.3病原學(xué)檢測(cè)4.3.1細(xì)菌分離培養(yǎng)和涂片鏡檢操作無(wú)菌采集血液、肝臟、肺臟、脾臟等發(fā)病器官病料（病料采集，具體NY/T541要求執(zhí)行），無(wú)菌接種環(huán)沾取采集到的病料，劃線接種于NA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h~24h后觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。挑選單個(gè)優(yōu)質(zhì)菌落接種于MAC培養(yǎng)基中，選取粉紅色、質(zhì)地粘稠、中等大小的典型單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)。注：具體NA，MAC培養(yǎng)基配制方法見(jiàn)附錄A1,A2。培養(yǎng)形態(tài)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，菌落呈灰白色圓形隆起、邊緣整齊、濕潤(rùn)黏稠；在45°斜射光下可見(jiàn)明亮熒光，見(jiàn)附錄A3圖1；在血瓊脂平板上形成濃厚、灰白色、圓凸閃光的菌落，不溶血；在麥康凱瓊脂上形成粉紅色粘稠菌落，表面濕潤(rùn)，具有擴(kuò)散性，菌苔密集處菌落呈黃色，見(jiàn)附錄A3圖2；在SS瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h后形成粉紅色菌落，培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色，培養(yǎng)48h后，菌落及培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。鏡檢形態(tài)挑取單個(gè)菌落涂片、革氏染色、鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)，應(yīng)為革蘭氏陰性粗短桿菌，單在或成對(duì)排列、有莢膜、無(wú)芽胞。見(jiàn)附錄A3圖3。4.3.2生化試驗(yàn)操作步驟將純培養(yǎng)菌分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、C、尿素、MR、VP、硫化氫、吲哚、明膠、三糖鐵等微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18h~24h后觀察結(jié)果。生化結(jié)果見(jiàn)表格。葡萄糖?枸櫞酸鹽（＋）乳糖?尿素（＋）麥芽糖?MR試驗(yàn)（-）甘露醇?VP試驗(yàn)（＋）蔗糖?硫化氫生成試驗(yàn)（-）阿拉伯糖?吲哚試驗(yàn)（-）鼠李糖＋明膠（-）木糖＋三糖鐵(TSI)反應(yīng)?不產(chǎn)生H2S注：4.3.3致病性檢驗(yàn)及動(dòng)物回歸試驗(yàn)操作步驟取20只小鼠和20只20日齡雛禽各隨機(jī)分為2組，即小鼠、雛禽試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各10只。對(duì)照組，隔離飼養(yǎng)，不做攻菌處理；實(shí)驗(yàn)組無(wú)菌吸取上述經(jīng)生化鑒定的分離菌的血清肉湯純培養(yǎng)物腹腔注射實(shí)驗(yàn)組小白鼠和雛禽，每只注射0.3mL（4.05×1011CFU/mL）。注射后小鼠和雛禽隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況，并對(duì)死亡小鼠和雛禽的心血、腦、肝臟、脾臟進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。結(jié)果觀察到試驗(yàn)組小鼠和雛禽注射24h后應(yīng)表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡，毛皮粗糙豎起，呼吸急促、采食減少等現(xiàn)象；對(duì)照組小鼠和雛禽無(wú)此現(xiàn)象。攻菌小鼠各組發(fā)病率達(dá)90%以上，死亡率80%以上；攻菌雛禽各組發(fā)病率均達(dá)到100%，死亡率90%以上。將死亡小鼠和雛禽剖檢，小鼠和雛禽各個(gè)器官出血、充血、壞死，將心血、腦、肝臟、脾臟同4.3.1方法分離培養(yǎng)，應(yīng)得到細(xì)菌的培養(yǎng)特性、細(xì)菌形態(tài)、生化特性應(yīng)均與接種細(xì)菌一致，表明分離菌為禽克雷伯菌。注：病原學(xué)檢測(cè)有關(guān)試驗(yàn)使用蒸餾水按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》要求準(zhǔn)備。4.3.416SrRNA基因鑒定引物序列合成用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因序列的通用引物：27f:5ˊ-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3ˊ；1492r:5ˊ-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ。目的基因1450bp。模板制備提取待檢病料所分離培養(yǎng)的細(xì)菌基因組DNA。反應(yīng)體系加入提取的DNA（3μL）、上下游引物（各1μL）、TaqMix（15μL）、ddH2O（10μL）等試劑，終體系為30μL。DB21/T3625-20反應(yīng)條件應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀按相應(yīng)反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變5min；94℃變性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃終止反應(yīng)。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說(shuō)明及步驟對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，回收產(chǎn)物作為測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳見(jiàn)附錄A4圖4結(jié)果判定對(duì)所測(cè)出的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，即登陸NCBI網(wǎng)站（）的Blastn在線軟件，粘貼測(cè)序所得的16SrRNA基因序列，獲取與該基因同源高的序列和相應(yīng)的細(xì)菌名稱，若同源性大于97%，可以確定為同種細(xì)菌。4.3.5病原菌khe特異性基因鑒定引物序列應(yīng)用肺炎克雷伯菌獨(dú)有的體外溶血酵素基因（khe）作為PCR鑒定的靶序列，合成用于擴(kuò)增細(xì)菌khe基因序列的引物：khe-F:5ˊ-TGATTGCATTCGCCACTGG-3ˊ；khe-R:5ˊ-GGTCAACCCAACGATCCTG-3ˊ。目的基因428bp。模板制備按照通用型柱式基因組提取試劑盒說(shuō)明書提取待檢病料所分離培養(yǎng)的細(xì)菌基因組DNA。反應(yīng)體系在PCR反應(yīng)管中按相應(yīng)反應(yīng)體系加入提取的DNA（3μL）、上下游引物（各1μL）、TaqMix（15μL）、ddH2O（10μL）等試劑，終體系為30μL。反應(yīng)條件應(yīng)用PCR擴(kuò)增儀同16SrRNA反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)附錄A4圖5。結(jié)果判定對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到目的片段后，按照《瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒》（OMEGA）的說(shuō)明及步驟對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收和純化，回收產(chǎn)物作為測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序要求測(cè)通。對(duì)所測(cè)出的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，即登陸NCBI網(wǎng)站（）的Blastn在線軟件，粘貼測(cè)序所得的khe基因序列比對(duì)。綜合診斷結(jié)果判定5.1初步診斷根據(jù)流行病學(xué)特征和臨床癥狀，結(jié)合剖檢變化，可作出初步診斷。5.2依據(jù)病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果，做出確診。符合5.1，且按4.3.1、4.3.2、4.3.3規(guī)定的進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，用4.3.4或4.3.5中的任一方法檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性者，確診為禽克雷伯菌病。A1、NA（營(yíng)養(yǎng)瓊脂）培養(yǎng)基的配制：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA用于細(xì)菌總數(shù)測(cè)定、保存菌種基純培養(yǎng)，也可以用于消毒效果測(cè)定（GB/T4789.28-2003中，GB/T4789.28-2003，GB15979-2002和GB15981-1995,ISO標(biāo)準(zhǔn)）。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方（每升）：蛋白胨10g牛肉膏粉3g氯化鈉5g瓊脂15g最終pH7.3±0.2培養(yǎng)基使用方法：稱取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA33g，加入蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min，備用。A2、MAC（麥康凱瓊脂）培養(yǎng)基配制方法：麥康凱培養(yǎng)基供分離發(fā)酵乳糖的革蘭氏陰性腸道桿菌。（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版）。麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂的配方（每升）：胨20.0g牛膽鹽5.0g氯化鈉5.0g瓊脂14.0g乳糖10.0g中性紅0.03g最終pH7.2±0.2培養(yǎng)基使用方法：稱取麥康凱培養(yǎng)基54.0g，加入蒸餾水或去離子水1L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15min，備用。A3、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)圖1分離菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀態(tài)圖2分離菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀態(tài)圖3鏡檢下分離菌形態(tài)，革蘭氏陰性A4、鑒定菌株及khe基因PCR電泳圖圖4鑒定菌株16SrRNAPCR電泳圖