蛋白質組學相關概念與技術及其研究進展

蛋白質組學相關概念與技術及其研究進展蛋白質組學相關概念與技術及其研究進展/蛋白質組學相關概念與技術及其研究進展蛋白質組學相關概念與技術與其研究進展摘要:隨著后基因組時代的到來，蛋白質組學得到了空前的發(fā)展。包括蛋白質組、蛋白質組學、功能蛋白質組學和結構基因組學等新的概念和學科不斷涌現(xiàn)，并相應改進和發(fā)展了許多新的技術和研究手段，如雙向凝膠電泳、生物質譜、生物傳感芯片質譜、蛋白質芯片、和生物信息學等。關鍵詞:后基因組時代；蛋白質組；蛋白質組學；研究技術；發(fā)展趨勢；展望21世紀將是生命科學的世紀。繼2000年6月26日人類基因組工作框架圖繪制完成后，參與人類基因組計劃的美、日、法、德、英、中等六國科學家和美國塞萊拉公司于2001年2月12日聯(lián)合向世人正式公布了人類基因組圖譜與初步分析結果。這是生命科學史上的一次新飛躍，標志著后基因組時代的來臨。后基因組時代中，生命科學的中心任務則是闡明基因組所表達的真正執(zhí)行生命活動的全部蛋白質的表達規(guī)律和生物功能，即生命科學的研究重心將從基因組學轉移到蛋白質組學。1蛋白質組學相關的核心概念1.1基因組和蛋白質組蛋白質組這一概念是由澳大利亞學者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公開發(fā)表在1995年7月的Electrophoresis雜志上，指的是由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部相應的蛋白質。蛋白質組與基因組相對應，也是一個整體的概念，是基因組表達的全部蛋白。但兩者又有根本的不同之處?；蚪M是靜態(tài)的，一個有機體從它的發(fā)生、發(fā)展到衰老、死亡，不同細胞、組織和器官的基因組是基本穩(wěn)定不變的。但基因組內各個基因表達的條件和表達的程度則隨時間、地點和環(huán)境條件而不同，因而它們表達的模式，即表達產物的種類和數(shù)量隨時間、地點和環(huán)境條件也是不同的。所以，蛋白質組是一個動態(tài)的概念。它不僅在同一個有機體的不同組織和不同細胞中不同；在同一機體的不同發(fā)育階段，直至最后消亡的全過程中也在不斷變化；機體處于不同生理狀態(tài)下不同；在不同外界環(huán)境下也不同。實際研究中能夠取得的蛋白質組分子實體通常只是總蛋白質組的一部分?？梢娂仁钦w又是動態(tài)的蛋白質組的研究任務有多么繁重了。1.2蛋白質組學和功能蛋白質組學隨著蛋白質組的提出，蛋白質組學也自然而然地孕育產生。但目前,蛋白質組學仍無明確的定義，一般認為它是研究蛋白質組或應用大規(guī)模蛋白質分離和識別技術研究蛋白質組的一門學科，是對基因組所表達的整套蛋白質的分析。現(xiàn)階段，蛋白質組學研究的內容不僅包括對各種蛋白質的識別和定量化，還包括確定它們的細胞內外的定位、修飾、相互反應、活性，和最終確定它們的功能。并對由此獲取的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)庫構建，以與不可或缺的推動這一學科進步的蛋白質組分析技術研究。由于對全部蛋白質的研究是非常困難的，所以中國的科學工作者提出了一種全新的研究策略：功能蛋白質組學。它是位于對個別蛋白質的傳統(tǒng)蛋白質研究和以全部蛋白質為研究對象的蛋白質組研究之間的層次，研究特定時間、特定環(huán)境和試驗條件下基因組所表達的蛋白質。1.3結構基因組學蛋白質的功能主要決定于它們的三維結構，因此，認識蛋白質的空間結構將成為生命科學中最關鍵最具有挑戰(zhàn)性的前沿領域之一，于是促使了結構基因組學的興起與蓬勃發(fā)展。結構基因組學的概念是1998年在美國Aegonne召開的第一屆結構基因組學研討會上提出的。2000年4月第一屆國際結構基因組會議在英國Hinxton召開，正式定義結構基因組學為：在原子水平上闡明生物體的所有生物大分子的結構特性。即用基因組信息作為起始材料，在整個蛋白質組范圍內來大規(guī)模研究蛋白質結構，其主要目標是利用基因獲得其所有編碼蛋白質的結構與功能，從而獲得對有機體生命活動的全景式認識。2蛋白質組學研究技術蛋白質組研究主要包括樣品或組織中的蛋白質分離和分離蛋白質的鑒定兩個關鍵步驟。最初的主要研究技術僅僅是用于蛋白質分離和鑒定的二維凝膠電泳和質譜。但是，近幾年這個領域的急劇發(fā)展受到了多種力量的驅動,在原有技術的基礎上改進和衍生出許多新的技術。2.1蛋白質組研究的核心—用于分離的雙向電泳(Two—dimensionalElectrophoresis)目前已具有26年歷史的雙向凝膠電泳仍是蛋白質組學研究的核心技術。其基本原理：第一項基于蛋白質的等電點不同在pH梯度膠內等電聚焦；第二項則根據(jù)分子量的不同大小進行SDS分離，把復雜蛋白質混合物中的蛋白質在二維平面上分開。根據(jù)第一項等電聚焦條件和方式的不同，可將雙向電泳分為三種系統(tǒng)。第一種是在聚丙烯酰胺管中進行,載體兩性電解質在外加電場作用下形成梯度，這一系統(tǒng)被稱為ISO-DALT。它的最大缺點是不穩(wěn)定，易發(fā)生陰極漂移。第二種系統(tǒng)稱為IPG-DALT，主要是采用丙烯酰胺和不同的pH值的固定化電解質共聚所形成的具有pH梯度的IPG膠。第三種系統(tǒng)是非平衡pH梯度電泳,，常常被用來分離堿性蛋白質。蛋白質被分離以后用考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色或放射性標記等方法顯示。其中銀染方法非常靈敏,蛋白質分辨率可以達ng級。由于雙向電泳利用了蛋白質兩個彼此不相關的重要性質分離，其分辨率非常高。一般一塊蛋白質雙向電泳凝膠能分離到1000-3000個蛋白質樣點,最好的膠可以分離得到10000個以上蛋白質樣點。并且不同實驗室之間的實驗結果已經能夠相互比較。2.2生物質譜技術(MassSpectrometry)雙向電泳分離到的蛋白質往往是數(shù)目多、量少。生物質譜技術以其極高的靈敏度和對結果迅速的獲得使它正成為蛋白質鑒定分析的主要支撐技術，它是把樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的荷質比(m/z)的差異來分離并確定相對分子量。應用生物質譜技術鑒定蛋白質主要是根據(jù)蛋白質酶解后的肽質量指紋譜和肽序列信息去搜索蛋白質或核酸序列庫。電泳分離后凝膠上的蛋白質,需先用適當?shù)牡鞍變惹忻盖谐赡w段，再用質譜鑒定。凝膠內切酶靈敏度高，是當前廣泛采用的樣品制備方法。最常用的蛋白內切酶是胰蛋白酶，它在蛋白質主鏈上精氨酸和賴氨酸殘基的C端進行切割，靈敏度可達125fmol，而印記方法僅為0.5pmol。2.2.1肽質量指紋譜蛋白質直接從雙向電泳凝膠上切下或印跡到PVDF膜上并切下，經過原位酶解得到酶解肽段，然后用質譜得到這些肽段的精確質量，即獲得了肽質量指紋譜。由于每種蛋白質氨基酸序列都不同，當?shù)鞍踪|被酶解后，產生的肽片段序列也不同，其肽混合物質量數(shù)即具一定特征性。用實測的肽段質量去查找蛋白質和核酸序列庫,結合適當?shù)挠嬎銠C算法，可鑒定蛋白質。此外，根據(jù)肽段質量數(shù)變化，可對基因產生的插入、缺失、突變進行對比分析。當前，蛋白質的肽質量指紋譜測定常用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術。精度可達0.1個質量單位，靈敏度可以達到分解亞皮摩爾量的蛋白質,并且分析時間短，只需幾分鐘。2.2.2質譜測肽序列信息鑒定蛋白質肽序列信息一般用串聯(lián)質譜測得。液相分離的肽段經在線連接的電噴霧質譜儀檢測，質譜儀可選取肽段母離子并打碎并行成碎片離子，質量分析器測得碎片離子的質量，即得MS/MS質譜圖，根據(jù)MS/MS圖譜中不同碎片的質量差，可推測被測肽段的序列。然后利用一些相應的軟件去序列信息庫查找并鑒定蛋白質。2.3生物傳感芯片質譜MALDI—TOF—MS是上個世紀八十年代末發(fā)展起來并經過不斷改進的一種先進的離子化質譜技術。它通過肽質量指紋譜結合數(shù)據(jù)庫搜尋以分析蛋白質序列而進行蛋白質鑒定。但是它在蛋白質之間相互作用與結構與功能的相互關系分析方面顯得無能為力。而隨之利用生物傳感技術發(fā)展起來的生物分子相互作用分析技術是進行蛋白質相互作用分析的較好技術。將兩者有機結合起來便形成了生物傳感芯片質譜。它的核心是一塊小的生物傳感芯片，由金黃色的玻璃底物構成，此芯片在BIA和MALPI-TOF-MS中均可發(fā)揮作用。在BIA中，所需分析的可溶性蛋白質各自與結合在芯片表面的固定生物分子(受體)相互作用。滯留在芯片上的蛋白質通過與基質結合而從與受體分子的相互作用中解離出來，便可直接進行MALDI-TOF-MS。該法可用于篩選功能性蛋白質，并可在蛋白質水平篩選基因的多態(tài)性，從而能有效地將基因與蛋白質結合在一起。2.4蛋白質芯片蛋白質芯片是高通量、微型化和自動化的蛋白質分析技術。它是指在硅物質如玻璃等固相支持物表面高密度排列的探針蛋白點陣，通過如抗原—抗體專一性結合等各種相互作用可特異地捕獲樣品中的靶蛋白,然后通過檢測器對靶蛋白進行定性或定量分析。蛋白質芯片上的探針蛋白可根據(jù)研究的目的不同，選用抗體、抗原、受體、酶等具有生物活性、高度特異性和親和性的蛋白質。具體制備過程可參閱文獻。與DNA芯片一樣，蛋白質芯片同樣蘊涵著豐富的信息量，必須利用專門的計算機軟件包進行圖象分析、結果定量和解釋。它能夠同時分析上千種蛋白質的變化情況，可用于疾病診斷，蛋白質相互作用等研究，是蛋白質組學研究比較有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g工具。在最近的Science雜志上，Snyder等人報道了他們制作的一種蛋白芯片，可以在一次同時分析5800個酵母蛋白，迅速鑒定出能與成千上萬排列有序的酵母蛋白相互作用的蛋白。利用這一技術,，他們共發(fā)現(xiàn)了33種可以結合鈣調蛋白calmodulin的新蛋白和52種可以結合phosphotidy_linositides的蛋白。其中calmodulin是一種涉與鈣離子信號的廣泛存在的蛋白；phosphotidylinositides是一種與細胞生長、分化與細胞骨架重排有關的細胞膜蛋白。2.5蛋白質組學研究中的生物信息學(Bioinformatics)蛋白質組的信息主要包括蛋白質的性質、結構與功能,這也是當前蛋白質組學研究的主要任務。有關這方面的研究將大大難于以前僅僅序列的研究。并且蛋白質的二級和三級結構要涉與復雜的運算軟件的使用。要完成這些繁重而復雜的任務，沒有當今生物信息學的鼎立相助是不可想象的。生物信息學是指生物學與計算機科學以與應用數(shù)學等學科相互交叉而形成的一門新興學科,通過對生物大分子信息的獲得、加工、存儲、分類、檢索與分析，以達到理解這些生物大分子信息的生物學意義。可用于尋找蛋白質家族保守序列和對蛋白質高級結構進行預測。隨著相關軟件的成熟與發(fā)展，如今該學科已經成為基因組學和蛋白質組學研究中強有力的必不可少的研究手段。雖然蛋白質組學較傳統(tǒng)的蛋白質研究方法有很多根本性的進步，但它也有很多不完善和局限的地方。比如應用2-D凝膠電泳進行蛋白質組學分析時，就有可能檢測不出低豐度蛋白、跨膜和膜相關的蛋白質,而這些蛋白在蛋白轉運和信號轉導等許多生物學作用中有重要意義，這時候傳統(tǒng)的免疫學方法就能發(fā)揮有效的作用。蛋白質組學主要適用于大批量的研究和生物標記物的搜尋，以與獲取細、組織或器官整體表達的數(shù)據(jù)。簡言之,蛋白質組學是高通量的分析，是對傳統(tǒng)方法的補充。通常我們把蛋白質組學分析視為一個掃描工具，用以產生一系列的候選者，再以傳統(tǒng)的方法進行更深入的研究和功能分析。蛋白質組延續(xù)基因組發(fā)展而來并與之對應，但是又有著不同之處:一個生命體只有一個確定的基因組，為組成該機體的所有細胞共有；而蛋白質組則是一個動態(tài)的概念，它不僅在同一個機體的不同組織和細胞中不同，在同一機體的不同發(fā)育階段、不同的生理條件或疾病狀態(tài)下都是不同的。正是這種復雜的表達模式,構成了生命活動的復雜性和多樣性，也正是這種復雜的生命現(xiàn)象帶給了我們無窮挑戰(zhàn)和契機。對于蛋白質組學技術方法的了解和掌握無疑將賦予我們更具開拓性研究的利器。3蛋白質組學發(fā)展趨勢在基礎研究方面，近兩年來蛋白質組研究技術已被應用到各種生命科學領域，如細胞生物學、神經生物學等。在研究對象上，覆蓋了原核微生物、真核微生物、植物和動物等范圍，涉與到各種重要的生物學現(xiàn)象，如信號轉導、細胞分化、蛋白質折疊等等。在未來的發(fā)展中，蛋白質組學的研究領域將更加廣泛。在應用研究方面，蛋白質組學將成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一。在對癌癥、早老性癡呆等人類重大疾病的臨床診斷和治療方面，蛋白質組技術也有十分誘人的前景。目前，國際上許多大型醫(yī)藥公司正投入大量的人力和物力進行蛋白質組學方面的應用性研究。在技術發(fā)展方面，蛋白質組學的研究方法將出現(xiàn)多種技術并存，各有優(yōu)勢和局限的特點，而難以像基因組研究那樣形成比較一致的方法。除了發(fā)展新方法外，更強調各種方法間的整合和互補，以適應不同蛋白質的不同特征。另外，蛋白質組學與其他學科的交叉也將日益顯著和重要。這種交叉是新技術、新方法的活水之源，特別是蛋白質組學與其他大規(guī)?？茖W如基因組學、生物信息學等領域的交叉，所呈現(xiàn)出的系統(tǒng)生物學研究模式，將成為未來生命科學最令人激動的新前沿。國內從1997年開始開展蛋白質組研究，其中，中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所建立的蛋白質組研究中心在2000年的Electrophoresis上發(fā)表了我國第一篇蛋白質組研究論文，并在生命科學研究院生物信息中心的協(xié)助下建立了我國第一個大型的蛋白質組數(shù)據(jù)庫并實現(xiàn)了網絡共享(www.sibsproteome.org)。軍事醫(yī)學科學院和湖南師范大學也于2001年相繼發(fā)表了蛋白質組研究論文。國家自然科學基金委員會于1999年支持了蛋白質組重大項目，經過四年的發(fā)展，國內已形成一支蛋白質組研究隊伍,并擁有主要的研究技術和裝備，目前，已建立起基本蛋白質組平臺技術的有中國科學院上海生命科學研究院蛋白質組研究中心和軍事醫(yī)學科學院。已開展相關研究的單位還有湖南師范大學生命科學院、中國科學院大連化學物理研究所、復旦大學等。2001年，我國的蛋白質組研究又進入了一個迅速發(fā)展的新階段，其主要標志是國家科技部將蛋白質組研究確立為“973”和“863”的項目。在我國大力支持下，今后對蛋白質組的研究工作會發(fā)展的更為迅速，技術更為完善。盡管蛋白質組研究還處于初期發(fā)展階段，還存在很多不盡人意的地方，但是我們可以期望隨其深入發(fā)展，蛋白質組學研究在揭示生命活動的規(guī)律上會有所突破，并對探討重大疾病的機理、疾病診斷、疾病防治和新藥開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。相信隨著生物技術發(fā)展的深入和納米技術的興起，將為蛋白質組分析技術的發(fā)展、完善或突破帶來新的生機，基因組學、蛋白質組學、信息組學的蓬勃發(fā)展使21世紀將成為一個整體細胞生物學的時代。4前景與展望近年來，利用已有的工作基礎和技術儲備的特性，科研工作者已探索了農業(yè)生物蛋白質組的快速經濟分離鑒定方法,，包括雙向電泳樣品制備方法改進、蛋白質組預分離、蛋白質組多維色譜分離、蛋白質復合體分離、熒光素標定蛋白、納升級色譜分離等。隨著研究的不斷發(fā)展和深入，在完善現(xiàn)有的研究手段的同時，還必須發(fā)展一些新的研究技術。今后研究的重點是：功能蛋白和差異蛋白分析，主要技術路線是雙向電泳分離、多維色譜分離和質譜分析；蛋白質修飾分析，主要技術路線是修飾蛋白的富集分離和質譜分析；蛋白質復合體和蛋白質相互作用網絡分析，主要利用現(xiàn)有的蛋白質研究技術和設備開展蛋白質復合體的分離鑒定等。蛋白質組學是一門新興的學科，雖然剛剛起步，卻為大規(guī)模地直接研究基因功能提供了強有力的工具。目前，蛋白質組學在農業(yè)科學研究的多個領域得到初步應用，但低豐度蛋白的獲得和植物蛋白的定量仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。蛋白質組學不僅闡明生命活動規(guī)律提供物質基礎，也能為探討重大疾病的機理、疾病診斷、疾病防治和新藥開發(fā)提供重要的理論依據(jù)和實際解決途徑,解決了在蛋白質水平上大規(guī)模直接研究基因功能的問題。不難看出，它是基因組計劃由結構走向功能的必然，是生命科學由分析走向綜合的必經之路，也是連接微觀分子