3.2基因工程的基本操作程序課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修33

第3章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序從社會中來課本P76、76

在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花害蟲已有多年歷史?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌與殺蟲作用有關(guān)。蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲,科學(xué)家通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，讓該細(xì)菌的“殺蟲基因”轉(zhuǎn)移到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。(P76)①Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡從社會中來課本P76、76

在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花害蟲已有多年歷史?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌與殺蟲作用有關(guān)。蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲,科學(xué)家通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，讓該細(xì)菌的“殺蟲基因”轉(zhuǎn)移到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。(P76)②抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響從社會中來課本P76、76

在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花害蟲已有多年歷史?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌與殺蟲作用有關(guān)。蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲,科學(xué)家通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，讓該細(xì)菌的“殺蟲基因”轉(zhuǎn)移到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。(P76)你知道培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？蘇云金桿菌與載體拼接篩選抗蟲棉提取普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞導(dǎo)入抗蟲基因（Bt抗蟲蛋白基因）重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定實例：具體的步驟是？(含抗蟲基因）（含有并表達(dá)抗蟲基因）1、目的基因的篩選與獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定核心有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?Part1基因工程的基本操作程序目的基因的篩選和獲取第一步：801目的基因的篩選和獲取在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因。1、目的基因：目的基因也可以是一些具有調(diào)控作用的因子，調(diào)控其它基因的表達(dá)。

第一步：目的基因的篩選與獲取注意：

所有的基因都編碼蛋白質(zhì)或肽鏈?；虻姆N類一般分為結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄基因和調(diào)控基因。結(jié)構(gòu)基因的功能：具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，能控制生物性狀（編碼蛋白質(zhì)或肽鏈）。轉(zhuǎn)錄基因的功能：只有轉(zhuǎn)錄功能，沒有翻譯功能，能轉(zhuǎn)錄形成tRNA和rRNA。調(diào)控基因的功能：不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能調(diào)控其他基因的表達(dá)。知識拓展：基因不是01目的基因的篩選和獲取2.篩選合適的目的基因1.較為有效的方法之一從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。2.認(rèn)識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會和可能。101目的基因的篩選和獲取

序列數(shù)據(jù)庫以堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內(nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫

序列比對工具把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的工具。通過比對識別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能測序技術(shù)測定核酸和蛋白質(zhì)序列2.篩選合適的目的基因3.實例：Bt

抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害也對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物——Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解。蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)不僅掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因101目的基因的篩選和獲取

明確了目的基因后，該怎么獲得它?3.目的基因的獲取方法?獲取目的基因的方法：①利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因②從基因文庫中獲取③人工合成前提：方法：DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成（常用）01目的基因的篩選和獲取1301目的基因的篩選和獲?。?）人工合成3、目的基因的獲取在我國首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的培育過程中，科學(xué)家人工合成了目的基因。前提：基因比較小、核苷酸序列已知DNA合成儀（2）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理：DNA半保留復(fù)制，即在體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。（特異性地快速擴(kuò)增目的基因）？提取蘇云金桿菌能量2.DNA體外復(fù)制（PCR）的條件：體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物無需解旋酶，用高溫(90℃以上)代替DNA模板(含目的基因的DNA片段)4種脫氧核苷酸(dNTP)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（變性）提供相對穩(wěn)定的pH環(huán)境；一般添加Mg2+，真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）2種引物(常為小的單鏈DNA，通常為20-30個核苷酸)01目的基因的篩選和獲取ATPdNTP控制溫度，使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行01目的基因的篩選和獲取控制溫度，使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）②PCR條件:四種脫氧核苷酸(或四種dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶1701目的基因的篩選和獲取拓展：dNTP和ATP的結(jié)構(gòu)ATPADP+Pi+能量酶1801目的基因的篩選和獲取拓展：dNTP和ATP的結(jié)構(gòu)dNTPNMP+PPi+能量酶dNTP和ATP類似,不但可以提供原料還可以提供能量，無需添加ATP。1901目的基因的篩選和獲取3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2根據(jù)一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物（不需要知道整個目的基因的堿基序列）拓展：引物引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸需要引物的原因？DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈。20子鏈的延伸方向為5′端→3′端約為2n指數(shù)形式擴(kuò)增變性復(fù)性延伸PCR技術(shù)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相同點原則條件延伸方向不同點解旋方式場所延伸用酶溫度過程結(jié)果堿基互補(bǔ)配對DNA母鏈作為模板、引物(體內(nèi)引物mRNA、體外引物DNA）、4種脫氧核苷酸為原料、能量90℃以上高溫變性解旋解旋酶催化PCR擴(kuò)增儀細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶DNA聚合酶需要在不同溫度下進(jìn)行（90℃以上變性、50℃左右復(fù)性、72℃左右延伸）細(xì)胞內(nèi)溫和條件擴(kuò)增特定的DNA片段或基因形成完整的子代DNA新鏈都是從5’端向3’端延伸2301目的基因的篩選和獲取(1)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時，需要

引物。(2)圖2是某同學(xué)設(shè)計的兩組引物（只標(biāo)記了部分堿基序列），但都不合理，請分別說明理由：

2第一組：引物1與引物2發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對而失效；第二組：引物1自身折疊會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效。兩種引物需要符合以下要求，否則引物失效，得不到擴(kuò)增產(chǎn)物：每種引物內(nèi)部不能發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對，否則會導(dǎo)致自身折疊。兩種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，否則會導(dǎo)致引物自連。2401目的基因的篩選和獲取(3)()要在兩種引物的5’分別加上限制酶的識別序列引物1是5’—CTTCGAAATTC—3’引物2是5’—CCGATCGGGAGA—3’設(shè)計引物的依據(jù)：3+2P65通常是目的基因兩端的目的序列，要保證目的基因能與載體連接，要在兩種引物的5’分別加上限制酶的識別序列,且常在兩種引物設(shè)計上加上不同的酶切位點，主要目的是保證目的基因與載體的正向連接。2501目的基因的篩選和獲取長度相同，但G-C含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高；但復(fù)興溫度過高，又破壞引物與模板的結(jié)合，可能導(dǎo)致PCR得不到任何產(chǎn)物。(4)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)性溫度與設(shè)計引物（如長度堿基組成）有關(guān)，請分析原因：①n代后，DNA分子有_____個②n代后，DNA鏈有_____條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有_____個⑤n代后，含其中一種引物的DNA分子有_____個⑥n代后，共消耗_____個引物⑦第n代復(fù)制，消耗了______個引物⑧n代后，完整的(等長）目的基因有_____個2n2n+132n2n+1-22n2n-2n2n-101目的基因的篩選和獲取(5)根據(jù)PCR技術(shù)找出以下規(guī)律：1.(2022·天津一中高二期中)下圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列敘述錯誤的是A.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B.在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段C.引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，則不能有效擴(kuò)增目的基因D.經(jīng)過1輪循環(huán)后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數(shù)量相同?！?12.用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。28逆轉(zhuǎn)錄成目的基因（cDNA）與自然條件下該基因結(jié)構(gòu)一樣嗎？DNA片段基因1

基因2

基因3放大終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子原核基因知識補(bǔ)充原核基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶識別和結(jié)合位點結(jié)束轉(zhuǎn)錄mRNA蛋白質(zhì)翻譯原核基因的編碼區(qū)是連續(xù)的，不存在外顯子與內(nèi)含子之分。DNA基因1基因2基因3放大轉(zhuǎn)錄內(nèi)含子內(nèi)含子外顯子真核基因的編碼區(qū)是不連續(xù)的，存在外顯子與內(nèi)含子之分。mRNA單鏈提取逆轉(zhuǎn)錄酶DNA單鏈DNA雙鏈(cDNA)酶30編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列知識補(bǔ)充真核基因的結(jié)構(gòu)【總結(jié)】原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較不能編碼蛋白質(zhì)的序列=

非編碼區(qū)原核生物的基因：不能編碼蛋白質(zhì)的序列真核生物的基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼知識補(bǔ)充01目的基因的篩選和獲取32（3）從基因文庫中直接獲取3、目的基因的獲取基因組文庫部分基因文庫（主要是cDNA文庫）基因文庫：基因組文庫：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。部分基因文庫：含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。基因組文庫從細(xì)胞中提取DNA細(xì)胞基因組DNA質(zhì)粒質(zhì)粒酶切DNA連接酶連接限制酶酶切導(dǎo)入細(xì)菌中基因組文庫克隆提取酶切的DNA片段cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶酶切的cDNA片段限制酶酶切質(zhì)粒質(zhì)粒酶切連接導(dǎo)入細(xì)菌中cDNA文庫克隆提取基因組DNA限制酶酶切mRNA逆轉(zhuǎn)錄得cDNA拼接質(zhì)粒，導(dǎo)入細(xì)菌中保存為文庫基因組文庫cDNA文庫選擇含有目的基因的克隆，用構(gòu)建文庫時的限制酶切割獲得目的基因34基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以【思考】從基因組文庫中獲得的胰島素基因（含內(nèi)含子），若以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到對應(yīng)的胰島素，其原因可能是？胰島素基因含內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列不能被切除，無法表達(dá)出胰島素思考：能不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，為什么？如果不能，如何避免該結(jié)果的發(fā)生呢？

①游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞后，一般會直接被分解。

②就算沒有被破壞且能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，游離的DNA也無法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。核心工作——基因表達(dá)載體構(gòu)建36Part2基因工程的基本操作程序第一步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建3702基因表達(dá)載體的構(gòu)建確保基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（核心工作）1.目的：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。DNA復(fù)制的起始位點位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄便于重組DNA分子的篩選和鑒定。誘導(dǎo)型啟動子：當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)基因表達(dá)載體是載體的一種啟動子、終止子就是起始密碼子、終止密碼子嗎？02基因表達(dá)載體的構(gòu)建項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)_________________________位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能_________________________________________________________________________________________________________________________DNADNAmRNAmRNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)2.啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比383.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程③再利用

將含目的基因的DNA片段拼接到

的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子（基因表達(dá)載體）。目的基因限制酶切割位點標(biāo)記基因啟動子限制酶切割位點終止子復(fù)制原點限制酶限制酶DNA連接酶①首先用一定的

切割載體（質(zhì)粒），使它出現(xiàn)一個切口。②然后用

限制酶或能產(chǎn)生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。限制酶同種相同DNA連接酶載體02基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因應(yīng)插入啟動子和終止子之間，以保證目的基因的表達(dá)02基因表達(dá)載體的構(gòu)建【思維拓展】作為基因工程表達(dá)載體，包含目的基因，標(biāo)記基因，啟動子，終止子等多種功能元件，這些功能元件是質(zhì)粒自帶的嗎？不一定，有些是根據(jù)需要人為添加的。例如若想目的基因在某種特定細(xì)胞中表達(dá)，就需要在質(zhì)粒中加上在這種細(xì)胞中特異性表達(dá)的啟動子，從而保證目的基因的表達(dá)。只有使用受體生物自身的啟動子才比較有利于基因的表達(dá)4.酶切位點的選擇圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。(1)上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞

和

。(2)在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，

。目的基因抗性基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中03基因表達(dá)載體的構(gòu)建(3)在基因工程的操作中，若只選PstI這種限制酶進(jìn)行切割，可能會造成什么后果？如何解決？若只選PstI這種限制酶進(jìn)行切割，可能造成目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化、目的基因與質(zhì)粒的反向連接等問題。圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。雙酶切034.選擇酶切位點的原則

小結(jié)：

①選目的基因兩端和載體都有的酶切位點；

②所選酶切位點不能破壞目的基因和標(biāo)記基因,啟動子，終止子，復(fù)制遠(yuǎn)點；

③切割質(zhì)粒時，至少保留一個完整的標(biāo)記基因，便于篩選；

④為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化、目的基因與質(zhì)粒的反向連接，應(yīng)

使用不同的限制酶分別切割含有目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，如圖可

選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶，該方法稱為雙酶切法。031：某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題：→四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因←03結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種：含有環(huán)狀目的基因；含有質(zhì)粒載體；含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（普通大腸桿菌）含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌→四環(huán)素

抗性基因氨芐青霉素

抗性基因←03（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是______________________________________________________________________________；并且_________________和____________________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是________________________________________________________________________________________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有_____________的固體培養(yǎng)基。未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（普通大腸桿菌）含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都不能生長含有質(zhì)粒載體含有重組質(zhì)粒的二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素03未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（普通大腸桿菌）含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌甲：

物質(zhì)

乙：

物質(zhì)在含乙的培養(yǎng)基中，含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌生存狀況為

（存活/死亡）。氨芐青霉素四環(huán)素死亡032.B將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？P80針對性差，完全靠運(yùn)氣，也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w細(xì)胞

由于不同轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品所需要的目的基因不同，受體細(xì)胞又有植物、動物、微生物之分，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法不是千篇一律的,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法也不是完全相同的。將目的基因與載體結(jié)合，構(gòu)建好基因表達(dá)載體后，下面該進(jìn)行什么操作？基因工程第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞思考51Part3基因工程的基本操作程序第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞5203將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法

將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法我國科學(xué)家獨創(chuàng)十分簡便經(jīng)濟(jì)的方法常用自主思考：閱讀課本相關(guān)內(nèi)容（P80-82），總結(jié)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有哪些，各個方法的原理是什么？各自適用于什么生物？5303將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）花粉管通道法②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞受體細(xì)胞：一般為受精卵子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊5403將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。①轉(zhuǎn)化：②農(nóng)桿菌特點：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力；b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。當(dāng)植物體收到傷害時，傷口處的細(xì)胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細(xì)胞。表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)第一次導(dǎo)入第二次導(dǎo)入第一次拼接第二次拼接將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。Ti質(zhì)粒T—DNA目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程：03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。5603將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法1.目的基因?qū)胫参锛?xì)胞④導(dǎo)入的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；受體細(xì)胞為：體細(xì)胞或受精卵b.可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等；用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功!57032.目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）常用方法：（2）受體細(xì)胞:顯微注射法受精卵體積大，易操作；易表現(xiàn)出全能性。（3)過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物58（1）常用方法：Ca2+處理原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）目的：可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。(感受態(tài)細(xì)胞)（2）受體細(xì)胞：優(yōu)點：繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)。3.目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（3）過程：Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子轉(zhuǎn)錄翻譯加工如果把一個真核生物的基因?qū)朐思?xì)胞中表達(dá)，一定會產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)嗎？一般不能產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)原因：①原核生物細(xì)胞里沒有相應(yīng)的機(jī)制來去除內(nèi)含子；②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）相應(yīng)機(jī)制剪切內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄出來的序列真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）前體mRNA成熟mRNA多肽鏈蛋白質(zhì)6004目的基因的檢測與鑒定將表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達(dá)？61Part4基因工程的基本操作程序第四步：目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定1.檢測與鑒定的方法檢測目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性。目的：(1)分子水平的檢測：(2)個體生物學(xué)水平鑒定：③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①檢測目的基因是否插入受體細(xì)胞染色體DNA

上自主學(xué)習(xí)：閱讀課本相關(guān)內(nèi)容（P82），總結(jié)目的基因檢測水平有哪些？對應(yīng)的方法有哪些？6304目的基因的檢測與鑒定類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)（分子雜交技術(shù)）目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等2.檢測內(nèi)容及方法:6404目的基因的檢測與鑒定1.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法：PCR擴(kuò)增和DNA分子雜交技術(shù)1.制作與目的基因序列相同的有同位素標(biāo)記的DNA片段，并用PCR擴(kuò)增（基因探針）2、提取受體細(xì)胞全部DNA，與基因探針置于同一培養(yǎng)液。3、高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N變性變性15N雜交DNA分子（可檢測）1.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因基因探針待測DNA基因探針：常用目的基因的單鏈DNA片斷制成，帶有某種（如放射性）標(biāo)記。

能與目的DNA的一條鏈或與RNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對。

04目的基因的檢測與鑒定6604目的基因的檢測與鑒定2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴(kuò)增和分子雜交技術(shù)1.制作出與目的基因序列相同的有同位素標(biāo)記的DNA片段，并用PCR擴(kuò)增（基因探針）2、提取受體細(xì)胞全部RNA，直接與基因探針置于同一培養(yǎng)液?；蛳葘NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再與基因探針置于同一培養(yǎng)液。3、高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)分子雜交片段。RNA的PCR04目的基因的檢測與鑒定2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴(kuò)增和分子雜交技術(shù)6804目的基因的檢測與鑒定3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法:抗原-抗體雜交技術(shù)若出現(xiàn)雜交帶，則目的基因成功翻譯出蛋白質(zhì)。蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交脫分化6904目的基因的檢測與鑒定轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實驗）未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長個體水平：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常總結(jié)1.目的基因的篩選和獲取利用PCR獲取和擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成從基因文庫中獲取2.構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、Ca2+處理(微生物);4.目的基因的檢測與鑒定分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?1Part5基因工程的基本操作程序DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實驗.探究DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定探究.實踐一、實驗原理1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。變性90?C延伸72?C復(fù)性50?CDNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。探究.實踐2.DNA片段電泳鑒定的原理二、材料用具①PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水。(離心管)⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等二、材料用具注：模板DNA的用量為1pg-1ugDNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）。參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。移液離心擴(kuò)增探究.實踐三、方法步驟使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結(jié)合DNA片段的擴(kuò)增PCR技術(shù)DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種