DB37-T 4711-2024海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程

ICS07.080CCSZ06ICS07.080CCSZ06山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T4711—2024DNA技術(shù)規(guī)程CodeofpracticeformonitoringmitochondrialDNAgeneticdiversityofCodeofpracticeformonitoringmitochondrialDNAgeneticdiversityofmarineanimalresources2024041120240511山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布目 次前言 II112范引文件 13語定義 14測序 15測案計(jì) 26品集保與輸 26.1采地點(diǎn) 26.2采數(shù)及法 26.3采記錄 36.4樣保與輸 37品測 37.1方原理 3DNA提取 3DNA質(zhì)檢測 37.4引選擇 3DNA擴(kuò)增 4PCR產(chǎn)回、與序測定 48量制 49據(jù)析 410測告 4附錄A（料）樣采集錄 5附錄B（料）設(shè)與試劑 6B.1儀設(shè)與材 6B.2試及配制 6附錄C（料）酚仿法取DNA 7附錄D（料）瓊糖凝電泳 8附錄E（料）PCR增反體系 9附錄F（料）檢記錄 10參考獻(xiàn) 11前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由山東省海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測技術(shù)規(guī)程范圍本文件確立了海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測程序，規(guī)定了監(jiān)測方案設(shè)計(jì)、樣品采集、保存與運(yùn)輸、樣品檢測、質(zhì)量控制、監(jiān)測報(bào)告等技術(shù)要求，描述了數(shù)據(jù)分析方法。本文件適用于海洋動物資源的遺傳多樣性監(jiān)測。（GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法下列術(shù)語和定義適用于本文件。下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1遺傳多樣性geneticdiversity種內(nèi)不同群體之間或一個群體內(nèi)不同個體的遺傳變異總和。4監(jiān)測程序海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測程序包括監(jiān)測方案設(shè)計(jì)、樣品采集、保存與運(yùn)輸、樣品檢測、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測報(bào)告，程序見圖1。圖1監(jiān)測程序圖101采樣地點(diǎn)可根據(jù)調(diào)查需求選擇：GB/T12763.6GB/T18654.2300.5g；視監(jiān)測生物的具體情況，無菌操作剪取部分魚類鰭條組織約0.1g，0.5mL；0.1mL采集的每批樣品分別填寫樣品采集記錄，格式參見附錄A。4～1024h10cm310（95）（polymerasechain（deoxyribonucleicDNAD-loopI（CytochromeoxidaseI，COI）DNA0.1DNADNADNACDNADNA提取的DNA用洗脫液或滅菌雙蒸水溶解，取5μL經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA質(zhì)量，電泳方法參DNA50ng/μLDNA20DNA2～3Tm值50～6018bp～24bpG+C40%～60PCRbp～600bpDNA用合成的引物對樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。按每對引物的Tm值設(shè)定退火溫度，按7.5.2進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，選擇PCR產(chǎn)物條帶單一、清晰、且長度與預(yù)期一致的引物，作為該物種的遺傳多樣性監(jiān)測引物。DNAPCR。PCR945min；9430s，X30s（XTm），7230s～60s，357210min，4PCR對所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，選擇單一、清晰、且長度與預(yù)期一致的條帶，回收純化目的片段后測序，或PCR產(chǎn)物直接雙向測序。每批PCRDNA瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，每排樣品中至少要同時(shí)加一個合適的DNA分子量梯度標(biāo)準(zhǔn)品。（MaximumComposite（、）F10監(jiān)測報(bào)告樣性保護(hù)存在的問題及保護(hù)建議等。采樣人：復(fù)核人：采樣人：復(fù)核人：附錄A（）海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測采樣記錄見表A.1。表A.1樣品采集記錄表種名樣品編號樣品數(shù)量樣品規(guī)格采樣時(shí)間樣品捕撈海域采樣方式現(xiàn)場調(diào)查采樣：地籠；非現(xiàn)場調(diào)查采樣采樣地點(diǎn)經(jīng)度：緯度：碼頭/市場樣品組織整體；肌肉；血液；鰭條；其他：樣品外觀鮮活；新鮮；變質(zhì)保存方式活體；冷凍；冰鮮；常溫；其他：備注附錄B（資料性）設(shè)備與試劑儀器設(shè)備與耗材應(yīng)符合以下要求：0.001g；12000r/min；1000μL200μL、100μL10μL、2.5μL；PCR1.5mL、0.2mL；：1000μL、200μL、10μLK（20mg/mL）；K（20mg/mL）；20g1000mLTE（Tris-HCl1mol/L，EDTA0.5mol/L，pH=8.0），c)乙醇：75%、95%以上；Taq（dNTPs）；PCRDNA6×Tris（pH=8.0）；TBETris108g，EDTA-Na27.44g55g，1000mL附錄C（資料性）酚-氯仿法提取DNA1.5mL100mgCTAB600μL、蛋白酶K（20553h375001000rpm5500μLB.250030000rpm5400μL2202012000rpm5min75500μL，12000rpm3minB.712000rpm200μL15min～30min100μL附錄D（）1×TBE1%～1.51:10000（5μLDNA，1μL6DNA0.5×TBE，100V～120V30min254nm附錄E（）PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系配方見表E.1.表E.1PCR體系配方表DNA模板50ng～100ng10倍擴(kuò)增緩沖液2.5μLMgCl2(25mmol/L)2.0μLdNTP(10mmol/L)0.5μL引物f(50pmol/μL)0.5μLr(50pmol/μL)0.5μLTaq酶(5U/μL)0.2μL加無菌超純水配制成25μL的反應(yīng)體系附錄F（海洋動物資源線粒體DNA遺傳多樣性檢測記錄見表F.1。表F.1檢測記錄表樣品名稱樣品編號樣品數(shù)量引物序列目的序列長度（bp）單倍型1DNA序列群體間遺傳距離d’群體間平均遺傳距離d’群體內(nèi)個體間遺傳距離d～群體內(nèi)平均遺傳距離d單倍型數(shù)H單倍型多樣性Hdk核苷酸多樣