HIV感染的實驗診斷培訓課件

一、HIV感染后的免疫和病毒學8/23/20241HIV感染的實驗診斷HIV的基因組結構和蛋白基質衣殼核衣殼表面糖蛋白跨膜糖蛋白蛋白酶反轉錄酶整合酶HIV結構基因,有3個env(核苷酸5781--8360)編碼包膜蛋白p160、120、41等。gag(核苷酸310--1860)編碼病毒核心/衣殼蛋白p55、24、15、17；pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉錄酶(RT)、p66、51、32、11等；HIV調節(jié)基因,有6個tat:上調mRNA,促病毒復制-啟動rev:調節(jié)病毒mRNA-開關vif:增強出芽,釋放新病毒顆粒-感染因子nef:下調mRNA,抑病毒復制-制動vpu:僅見于HIV-1,功能不詳；vpx:僅見于HIV-2,功能不詳。8/23/20242HIV感染的實驗診斷8/23/20243HIV感染的實驗診斷5days8/23/20244HIV感染的實驗診斷腦部：巨嗜細胞和膠質細胞淋巴系統:胸腺淋巴結脾臟腸道：嗜鉻細胞前列腺精液陰道黏液骨髓肺胞巨嗜細胞血液細胞積存:CD4+T淋巴細胞巨嗜細胞膠質細胞嗜鉻細胞

Imagefrom:KahnandWalker,M.D.NEJM1998,Volume339:33-39

July28/23/20245HIV感染的實驗診斷感染HIV后的血清學變化HIVRNA濃度p24AgP24AgAnti-gp41,120,160Anti-p24,55感染1周2周6周12周8－10年急性期潛伏期艾滋病期檢出線8/23/20246HIV感染的實驗診斷HIV-1早期感染病毒標志物的動態(tài)觀察HIVRNAHIVp24antigenHIVantibodies窗口期血漿RNAP24前病毒DNAHIV抗體:ELISAHIV抗體:WB8/23/20247HIV感染的實驗診斷HIV感染者的三種臨床轉歸VirusCD4CD8aHIVCD4CD4CD8CD8aHIVVirusVirus典型8－10y快速:4-5y:(2%)緩慢/長期不進展:>10y:(2%)8/23/20248HIV感染的實驗診斷二、HIV酶聯篩查檢測方法和試劑※感染急性期，

窗口期※檢測試劑以ELISA為主，還有PA，斑點免疫膠體金和免疫層析。※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少?！?/p>

三四五代酶聯試劑的差異和使用策略：三代成熟質量穩(wěn)定，窗口期20d;四代提前4－9d，質量不穩(wěn)定，用于血站急性感染的檢測?！?/p>

篩查試驗和確認試驗的差異：酶聯試驗敏感性高于確認試驗，四代試劑敏感性更高，確認陰性的不一定是真陰性。

8/23/20249HIV感染的實驗診斷（一）HIV抗體ELISA檢測試劑（血液）第三代：雙抗原夾心法，可檢測所有類型抗體，由于能檢出IgM抗體，縮短了窗口期，有報道說較第二代產品平均可提前5天作出診斷。第四代：雙抗原（抗體）夾心法，將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被，再加入待檢血清，最后加入酶標記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體，同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體。第五代：HIV抗體和P24抗原實現分別檢測，真正實現早期診斷。8/23/202410HIV感染的實驗診斷FourthGenerationThirdGenerationSecondGenerationIgMIgG8/23/202411HIV感染的實驗診斷各種HIV檢測方法平均窗口期方法 平均天數第2代EIA 45第3代EIA 22P24抗原 16HIVRNA 118/23/202412HIV感染的實驗診斷（二）、檢測試劑的質量指標靈敏度診斷試驗的靈敏度有兩個不同意義：1．代表一個試驗能檢測最少量被分析物（如抗體）的能力。通?？蓪﹃栃匝暹M行稀釋以確認哪個試驗更敏感。2．指某試驗檢出陽性的能力（無假陰性）。一個試驗有可能檢出很少量的某抗體，但也可因試驗中缺少適當的抗原而漏掉一些陽性樣品。8/23/202413HIV感染的實驗診斷2．特異性指某試驗正確鑒定所有陰性的能力（無假陽性）。大部分HIV篩查試驗不是100%特異，可用公式計算真陰性特異度=————————

100%

真陰性+假陽性注：公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數。如100份血清，5份真陽性，95份真陰性，與參考試驗比較，某試驗檢出6份陽性（一份假陽性），則

特異性=94/(94+1)×100%=98.9%8/23/202414HIV感染的實驗診斷3．試驗效率指某試驗正確鑒定所有陽性和陰性的總體能力（無假陽性或假陰性），是靈敏度和特異性的綜合指標，反映了該試驗的總的效率。真陽性+真陰性試驗效率=—————————————

100%

真陽性+假陽性+真陰性+假陰性注:公式中真陽性和真陰性指試驗數目。在以上例子中，檢測100份血清，5份真陽性，95份真陰性，1份假陽性，1份假陰性，因此

4+94

試驗效率=————————

100%=98%4+1+94+18/23/202415HIV感染的實驗診斷4．預測值預測值與以上的參數不同，它描述的是考慮了被檢人群中感染的流行因素后的試驗評價。陽性預測值（PPV）：定義為在所有陽性結果人群中感染個體所占比例。陰性預測值（NPV）：定義為在所有陰性結果人群中未感染個體所占比例。真陽性陽性預測值=————————

100%

真陽性+假陽性真陰性陰性預測值=————————

100%

真陰性+假陰性注：公式中真陽性和真陰性指試驗數目。8/23/202416HIV感染的實驗診斷⑴在感染流行率較高（5%）的人群中1000人受檢：50份真陽性（已感染），950份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結果），5份假陰性（試驗結果），計算

PPV=45/(45+5)×100%=90%NPV=945/(945+5)×100%=99.5%

在另一人群有相同的結果（即相同數量的假陽性和假陰性）⑵在感染流行率較低的人群（0.7%）中

1000人受檢：7份真陽性（已感染），993份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結果），5份假陰性（試驗結果），計算

PPV=2/2+5=28.6%NPV=988/988+5=99.5%

8/23/202417HIV感染的實驗診斷5．艾滋病病原診斷中的幾個問題⑴明確不同實驗方法的意義和適應范圍：HIV血清學檢測方法可分初篩和確證兩類。HIV初篩試驗特異性不夠強，有時會造成一些假陽性結果，故在初篩試驗出現陽性結果時，應再重復試驗，若仍為陽性再用確證試驗（WestBlot）去證實。但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應（出現的條帶不夠判為陽性的標準），在正常的非感染者人群中發(fā)生比例<15%，所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清，有些標本被視為不確定。出現不確定結果時，可能是HIV早期感染或是非特異反應，應在1-6個月后復查，并結合個體的臨床表現、感染因素、WB帶型等綜合分析后做出結論。8/23/202418HIV感染的實驗診斷⑵針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段：HIV感染后兩周內，無法查到抗體。兩周后出現病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉錄酶活性。6-8周后抗體產生時，進行抗體檢測。診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數時間，可用血清學方法診斷。8/23/202419HIV感染的實驗診斷

⑶HIV抗體測定的預測值：試劑的敏感性和特異性可衡量優(yōu)劣，但不能完全決定一個測定結果正確與否的可能性大小，與預測值關系更大。預測值除與試劑好壞有關外，還取決于測定對象本身患病率的高低。由表1可以看出：在用ELISA法對高危人群檢測時，其陽性預測值為99.98%，而在非高危人群中，陽性預測值僅為18.94%（即查出陽性結果是真陽性的機率只有18.94%），反之陰性結果的機率為99.997%。

8/23/202420HIV感染的實驗診斷表1ELISA法HIV1抗體測定的預示值

人群

預示值(%)

陽性陰性舊金山同性戀人群

99.9880.06美國非高危人群

18.9499.9978/23/202421HIV感染的實驗診斷⑷HIV抗體檢測反應強度與HIV感染的概率：ELISA法可根據光密度（OD）值的強度直接確定。反應越強的血清，含有HIV抗體的可能性就越大。表2中正常獻血員（感染率30/10萬），中等強度反應時，HIV抗體陽性概率僅為1%，高強度反應時，則為86.1%。見表2。不僅要看陰陽結果，還要看反應強度或S/CO比值。8/23/202422HIV感染的實驗診斷表2HIV感染機率與ELISA反應強度的關系

人群HIV感染率（/10萬）

ELISA反應強度（%）低度中度高度非高危獻血員

300.00071.1386.1高危獻血員

950.00223.4895.2軍人

1500.00365.3996.9吸毒者

450001.9196.699.98/23/202423HIV感染的實驗診斷注：1、數字表示相應強度反應的血清中含有HIV抗體的概率2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。8/23/202424HIV感染的實驗診斷三、確認試驗WB為主，還有：線性免疫試驗（LIA）,放射免疫沉淀試驗（RIPA）和免疫熒光試驗（IFA）。WB存有培養(yǎng)病毒的宿主細胞成分，容易出現非特異性反應造成不確定結果，LIA使用重組蛋白（多肽），非特異性大大減少，試劑盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。8/23/202425HIV感染的實驗診斷（一）、HIV抗體強度與抗體帶型的關系抗體帶型<11～55～1010～15>15全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型11151642106721224612合計1218120498/23/202426HIV感染的實驗診斷（二）、HIV病毒載量與抗體帶型的關系載量帶型5×10～5×102

5×102～103

103～104

104～105

>105全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型4118171412166331211183322合計697978188/23/202427HIV感染的實驗診斷（三）、造成WB假陽性或不確定的原因1.實驗室操作中，陰性樣本被污染或洗滌不徹底。2.HIV感染急性期，窗口期附近，僅顯示gp160或120，或P24，P31，P55帶；此時ELISA往往已顯示陽性反應

3.晚期AIDS病人，部分抗體如P24，P31丟失4.其他病毒感染的交叉反應，如風疹，麻疹，腮腺炎等5.自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）6.腎衰竭和血透析7.遺傳性胰腺囊腫8.多次懷孕或輸血9.肝病10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。11.線粒體核酸和T細胞白細胞抗原引起的抗體8/23/202428HIV感染的實驗診斷在無高危行為的獻血和孕婦人群中，WB不確定率10-15%，甚至高達32％.Gag蛋白抗體條帶最常見。ELISA篩查陽性結果中，WB不確定占4-20%,俄羅斯報告占12.7%。我國，125份確認為HIV-1抗體陽性;條帶出現百分率為：gp160、p24為100%,

gp120、gp41、p66、p51和p31在96%以上,p17、p55分別為86.4%和85.6%.

上海，36例WB試驗gp120和p24雙陽性者的跟蹤隨訪和核酸輔助診斷發(fā)現，至少24例可判定為HIV-1感染。5例樣本的核酸測定結果與血清學隨訪檢測結果的符合率達到100%。25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進展，可以判定為HIV抗體陽轉。（四）WB不確定結果的有關數據8/23/202429HIV感染的實驗診斷（五）假陰性結果指EIA+WB的假陰性原因急性感染后的抗體遲反應不同HIV毒株型發(fā)病晚期抗體消失窗口期：幾周到6個月，與當地HIV流行率有關HIV亞型，M/N/O組間差異8/23/202430HIV感染的實驗診斷（六）、確認試驗不確定標本的常規(guī)處理按照《全國艾滋病檢測技術規(guī)范（2004年版）》的要求，只能作“3個月后復檢”的處理，三個月后復檢1次，連續(xù)2次，共6個月。其轉歸有兩種可能：仍呈現不確定或陰性，則診斷為HIV抗體陰性；帶型發(fā)生進展，符合HIV抗體陽性判斷標準，則診斷為HIV抗體陽性。后者是真正的窗口期感染者（一般為2-3個月，最長6個月）

，只占很小的比例；大多數為非感染者，但由于WB反應的敏感性而出現條帶。如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進行實驗診斷。8/23/202431HIV感染的實驗診斷確認結果不確定標本的輔助診斷1、病毒載量：RT-PCR,NASBA,b-DNA，高拷貝的結果提示感染。小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應做HIV感染處理。