NBD多肽治療實驗性潰瘍性結(jié)腸炎的實驗研究

1/1NBD多肽治療實驗性潰瘍性結(jié)腸炎的實驗研究NBD多肽治療實驗性潰瘍性結(jié)腸炎的實驗研究作者：

楊劍,崔淑蘭,龍友明,陳墾,王暉,王念林,謝文瑞,劉君君【摘要】目的觀察核因子B必需分子(NFBessentialmodulator，NEMO)結(jié)合的小分子多肽(micromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomain，NBD多肽)對實驗性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。

方法60只SD大鼠隨機分成治療組、對照組各30只，采用三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸法制作潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，治療組予腹腔注射1.3mg/100g體質(zhì)量的NBD多肽，對照組予等量生理鹽水，評估炎癥活動指數(shù)（IAI），給藥后7d處死相應(yīng)組的動物取結(jié)腸，肉眼觀察結(jié)腸黏膜病變且按損傷情況積分，行病理切片、蘇木素伊紅(hematoxylineosin，HE)染色，光鏡下評估組織損傷；取病變結(jié)腸組織切片行免疫組化檢測核因子B(NFB)表達，檢測髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)。

結(jié)果治療組大體形態(tài)損傷、組織學(xué)損傷評分、IAI評分分別為2.410.43、4.800.82、6.020.59，明顯低于對照組(3.500.51、6.901.13、3.050.51)(P0.05)；治療組MDA、MPO及NFB表達均低于對照組(P0.05)。

結(jié)論NBD多肽對于潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型有較好的治療作用，其作用與其抑制NFB表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】NBD多肽潰瘍性結(jié)腸炎動物模型NFB免疫組化Abstract:ObjectiveToobservetheTimeactivitycurveofthetherapeuticeffectofmicromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomainonexperimentalulcerativecolitisrat.MethodssixtySDratswererandomlydividedintotreatedandcontrolgroup.Ulcerativecolitisratmodelwasinducedbyenteroclysiswithtrinitrobenzenesulfonicacid(TNBS)，micromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomainwereadministeredbyintraperitonealintreatedgroup，andejustdosesliquornatriichloridiisotonicuswereadministeredlikelyincontrolgroup.IAIscorewereevaluated.assay．Thentheratswerekilledaccordingtogroupsin7daysafterthatthemodelwasmadefortheobservationofthecolonicpathologicchangesbynakedeyeandfortheestimationofthedamagescoresofcolonmucosa.Finally，thecolontissuewasfixedtomakepathologicalsectionandthedamagescoreoftissuewasobservedundermicroscope.AndthendamagedcolontissuespathologicalsectiontestexpressionofNFBbyimmunizinghistochemistry.ThenthevalueofMDA、MPOinsupernatantofsamplessdamagedcolontissuesdivideevenlyanoarweretestedaccordingtotheinstructionofthecorrespkit.Resultthetreatedgroupsbrieflyformdamagescores、damagescoresoftissue、IAIscoreare2.410.43、4.80.82、6.20.59，andtheyallarelowerthanthatofthecontrolgroup(3.50.51、6.91.13、3.050.51)(P0.05).AndthevalueofthethetreatedgroupsMPO、MDA、NFBarelowerthanthatofthecontrolgroup(P0.05).ConclusionmicromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomainhasprotectiveeffectagainstratulcerativecolitis，anditsmechanismrelatwiththeinhibitjionofnuclearfactorB.Keywords:NFBessentialmodulatorbindingdomain(NBD)peptide;ulcerativecolitis;animalmodel;NFB;immunohistochemistry潰瘍性結(jié)腸炎(UC)即慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎，是一種病因尚未完全明確的直腸和結(jié)腸的慢性炎癥性疾病，病程遷延，有癌變趨勢，近年來患病率呈上升趨勢。

目前研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子B（nuclearfactorB，NFB）參與了炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)的發(fā)病機制和病理生理過程，并在IBD發(fā)病過程中起著核心作用，是IBD炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)及瀑布樣效應(yīng)的開關(guān)［1］。

目前治療本病的藥物主要為氨基水楊酸類、腎上腺皮質(zhì)激素類、免疫調(diào)節(jié)劑等，取得了一定的治療效果，但毒副作用較大。

NBD多肽可以選擇性抑制NFB基因的表達，抑制促炎癥基因的表達，抑制自身炎癥反應(yīng)，有很好的應(yīng)用前景，而目前國內(nèi)、外尚未有應(yīng)用NBD治療實驗性IBD的研究，故利用TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC模型進行了NBD多肽治療的實驗研究。

1材料與方法1.1材料1.1.1動物SD大鼠60只，SPF級，雄性，體質(zhì)量180～220g，由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，合格證號：

粵監(jiān)證字2005A010。

1.1.2藥物NBD多肽，美國Sigma公司生產(chǎn)。

1.1.3試劑三硝基苯磺酸(TNBS)：

美國Sigma公司生產(chǎn)，批號：

P2297；髓過氧化物酶（MPO）測試盒及丙二醛(MDA)測試盒，南京建成生物工程研究所，批號均為040722；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號20060814。

兔抗NFB多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司提供。

SP試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒均購自上海西唐生物工程有限公司；無水乙醇、乙醚甲醛均為分析純。

1.2實驗方法1.2.1結(jié)腸炎動物模型的制備大鼠在試驗前1d禁食，用10%（）氨基甲酸乙酯(烏拉坦)0.1mL/kg腹腔注射麻醉。

將2，4，6TNBS溶于50%乙醇（）中至終濃度為100g/L，取聚丙烯導(dǎo)尿管1根，術(shù)前用液狀石蠟潤滑后，從大鼠肛門中插入深度約8cm達結(jié)腸部位，緩慢灌注TNBS/乙醇溶液，每只大鼠約0.3mL，制成大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。

1.2.2動物分組與給藥方法60只雄性大鼠隨機分成治療組和對照組，每組各30只。

治療組在造模前給予腹腔注射1.3mg/100g體質(zhì)量的NBD多肽1次，對照組在造模前給予腹腔注射1.3mL/100g體質(zhì)量的蒸餾水1次，待大鼠清醒后給予正常飲食，于造模后7d處死兩組大鼠并取結(jié)腸標本及血標本。

1.2.3結(jié)腸炎癥的評價在各時間點進行IAI評分，而后處死大鼠取病變結(jié)腸進行大體形態(tài)損傷、組織學(xué)損傷評分、病理切片+HE染色及MPO、MDA活性測定。

感染活動指數(shù)（inflamationactiveindex，IAI）評分，IAI=(體質(zhì)量下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+便血分數(shù))/3；正常大便成干而小粒狀，半稀便為糊狀但不粘肛門，稀便為液狀而且粘肛門；大體形態(tài)損傷按Luk等［2］的標準；組織學(xué)損傷按韓英等［3］的標準；常規(guī)病理切片+HE染色；MPO、MPA活性測定按試劑盒說明書盤(南京建成生物工程程公司)說明書操作。

1.2.4NFkB表達的檢測及評分用免疫組化SP法檢測，取結(jié)腸病變部位組織，甲醛溶液固定后石蠟包埋，組織切片脫蠟；將玻片置檸檬酸緩沖液中用醫(yī)用微波爐進行抗原修復(fù)，水洗；滴加30mL/L的H2O2室溫10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline，PBS)沖洗；正常血清在室溫下封閉15min，清除多余血清；滴加兔抗NFBP65多克隆抗體37℃孵育1h，PBS液沖洗；滴加生物素化的兔抗羊Ig抗體室溫孵育15min，PBS液沖洗：

滴加過氧化物酶標記的鏈霉親和素室溫孵育15min，PBS液沖洗；DAB顯色2～5min，蘇木素復(fù)染后，封片觀察。

PBS代替一抗作為空白對照，細胞染成黃色者為陽性，定位于細胞質(zhì)和(或)細胞核。

每張片隨機選取10個高倍視野(400)，用美國NikonSpot圖像采集處理系統(tǒng)采圖后，采用ImageProPlus5.0專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析，計算陽性細胞百分率（%）和平均吸光度（A）。

1.3統(tǒng)計處理采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以s表示，采用t檢驗，P0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果2.1兩組大鼠大體形態(tài)與組織損傷TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型病變主要在近肛門段結(jié)腸及降結(jié)腸，對照組大鼠可見結(jié)腸黏膜充血水腫、糜爛及潰瘍形成，部分腸段腸壁增厚，且病變呈現(xiàn)連續(xù)分布；將病變組織切片經(jīng)HE染色后，鏡下可見結(jié)腸黏膜潰瘍及偽膜形成，隱窩和黏蛋白減少或消失，淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，部分小鼠腸段還有纖維化形成，浸潤深度可達固有層或以下，而治療組病變則主要在黏膜層，病變明顯較輕。

兩組評分比較差異有顯著性(P0.01)，提示NBD多肽對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥具有治療作用，見表1、圖1。

2.2兩組大鼠炎癥活動指數(shù)(IAI)兩組大鼠在灌腸蘇醒后均逐漸出現(xiàn)懶動、拱背、厭食、體質(zhì)量下降、大便次數(shù)增多，主要為稀便和膿血便，但治療組癥狀明顯輕于對照組，差異有顯著性(P0.01)，說明NBD多肽對TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥具有治療作用。

見表1。

2.3兩組大鼠MPO、MDA活性測定經(jīng)NBD多肽處理的大鼠MPO、MDA活性明顯下降，說明NBD多肽對潰瘍性結(jié)腸炎局部組織細胞內(nèi)的過氧化狀態(tài)有抑制作用，減少氧化應(yīng)激，對結(jié)腸炎癥進展有抑制作用，見表1。

2.4兩組大鼠NFB的表達其主要表達于表皮、隱窩上皮細胞和巨噬細胞等。

治療組胞質(zhì)中多呈棕黃色而胞核中為淡黃色，對照組胞質(zhì)多為深棕黃色，陽性細胞百分率（%）和A值明顯降低，兩組比較差異有顯著性(P0.01)，說明對照組的NFB表達較為活躍，前炎癥介質(zhì)生成活躍，炎癥比較嚴重。

見表1、圖2。

表1兩組各項指標評分結(jié)果（略）Table1Scoresofeveryindexoftwogroups與對照組比較：

*P0.01圖2免疫組化結(jié)果(SPXXXX年首次從B細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強子B序列特異結(jié)合的蛋白因子。

現(xiàn)證實其廣泛存在于真核細胞內(nèi)，能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結(jié)合而促進轉(zhuǎn)錄和表達，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答以及細胞的增生、轉(zhuǎn)化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關(guān)。

NFB是重要的促炎轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下以非活性態(tài)存在于胞漿中，在TNF等胞內(nèi)外因子作用下使IB激酶催化對IB磷酸化，NFB產(chǎn)生核易位而激活，并進入細胞核內(nèi)，結(jié)合于基因啟動子5區(qū)含有B結(jié)合位點的TNF、IL2、IL6、IL8、TNFB、粒巨噬集落刺激因子、B整合素、黏附分子等炎性因子的基因位點上，促進相應(yīng)的基因表達、細胞因子釋放；釋放的細胞因子又可以反過來進一步活化NFB［5，7］，形成正反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，引起組織損傷［8］；抑制NFB的表達可以減輕炎癥，打斷這種正反饋過程。

但體內(nèi)其他正常生理活動必需的細胞因子的轉(zhuǎn)錄也需要NFB的活化，盲目地阻斷NFB的功能可干擾體內(nèi)正常的生理過程，非特異性的NFB抑制劑會產(chǎn)生嚴重副作用。

NFB的激活所需要的IKK復(fù)合物中，IK和IK有相似的結(jié)構(gòu)與較高的同源性，C端調(diào)節(jié)酶活性的螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域(helixloophelix，HLH)結(jié)構(gòu)可使激酶發(fā)揮高效活性，但必須在其中的6個氨基酸的區(qū)域(NEMObindingdomain，NBD)與2種調(diào)節(jié)亞基IK(也稱NEMO，NFBessentialmodulator，NFB必需調(diào)節(jié)物或IKAP，IKassociatedprotEin，IK連接蛋白)結(jié)合方能發(fā)揮作用。

據(jù)此設(shè)計合成的只有6個氨基酸的長度(H2NLeuAspTrpSerTrpLeuCOOH)的NEMO結(jié)合的NBD多肽，可以選擇性阻斷兩者的結(jié)合，阻斷干擾IKK、IKK與NEMO的相互作用，選擇性抑制NFB活性，抑制促炎癥基因的表達，從而改善IBD病情。

而且由于其作用具有選擇性，不至于影響NFB的所有功能，并避免完全抑制NFB的活性的毒副反應(yīng)，且還具有分子結(jié)構(gòu)小、活性極高、免疫原性低，進入細胞后不易被降解、設(shè)計、合成簡便等優(yōu)點，在具有良好的穿透性的透細胞性多肽載體幫助下可以順利地進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用。

本實驗中治療組的NFB表達較對照組明顯下降，證實了NBD多肽能抑制NFB的表達。

治療組的組織損傷、組織學(xué)評分均較對照組明顯減輕，作為反映臨床癥狀的IAI評分也是如此，與NFB的變化規(guī)律相同。

MPO、MDA作為反映組織氧化還原狀態(tài)和氧化應(yīng)激情況的指標，治療組明顯低于對照組，說明組織內(nèi)過氧化壓力減輕，氧自由基生成和造成的損傷降低，推測與NFB表達受到抑制后炎癥介質(zhì)產(chǎn)生減少有關(guān)。

總之，NBD多肽對于潰瘍性結(jié)腸炎有較好的療效，有必要進行更大規(guī)模的實驗來進一步證實。

【參考文獻】［1］龍友明,陳墾.核因子B與炎癥性腸?。跩］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2003,12(4):394397.［2］LUKHH,KOJK,FUNGHS,etal.Delineationoftheprotectiveactionofzincsulfateonulcerativecolitisinrats［J］.EuropeanJPharmacol,2002,443(1-3):197-204.［3］韓英,村田有志,伊東重毫,等.長期應(yīng)用尼古丁對噁唑酮誘導(dǎo)的實驗性小鼠腸炎模型的影響及其機制探討［J］.中華消化雜志,2001,21(8):473-476.［4］PAPPM,NORMANGL,ALTORJAYI,et