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文檔簡介
1/1miR-130b-3p有望作為人膀胱癌的標志物miR-130b-3p有望作為人膀胱癌的標志物miR-130b-3p有望作為人膀胱癌的標志物呂夢欣池虹陳俊霞重慶醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室摘要:
目的進一步了解miRNA在膀胱癌中的潛在機制。
方法芯片分析4對人膀胱癌組織和相鄰正常組織中的miRNA的表達。
并用RT-qPCR來驗證兩個最上調(diào)的miRNA及其靶基因的表達是否符合miRNA/mRNA芯片結(jié)果。
通過相關(guān)性分析和雙熒光素酶報告實驗推斷并驗證miR-130b-3p可以靶向PTEN。
應(yīng)用CCK8、EDU、流式細胞術(shù)、劃痕、Transwell和細胞骨架等實驗證明miR-130b可以影響膀胱癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。
用Westernblot檢測PI3K/AKT和整合素1/FAK信號通路的關(guān)鍵靶蛋白。
結(jié)果人膀胱癌中miR-130b-3p表達高于癌旁且與PTEN表達呈負相關(guān)。
miR-130b-3p可下調(diào)PTEN表達,導(dǎo)致PI3K/AKT和整合素1/FAK信號通路的激活,且與膀胱癌EJ細胞的增殖、遷移和侵襲相關(guān)。
細胞轉(zhuǎn)染miR-130b-3p抑制劑時,可以重排細胞骨架。
結(jié)論本結(jié)果揭示miR-130b/PTEN有望用于人膀胱癌診斷和治療的標志物。
關(guān)鍵詞:
芯片;miR-130b-3p;PTEN;膀胱癌;作者簡介:
陳俊霞:chjunxia@126.com收稿日期:
2016-11-21基金:
國家自然科學(xué)基金(81672536,81372203)miR-130b-3pmayserveasamarkerforhumanbladdercancermiR-130b-3pmayserveasamarkerforhumanbladdercancerLYUMeng-xinCHIHongCHENJun-xiaDept.ofCellBiologyandGenetics,ChongqingMedicalUniversity;Abstract:
ObjectiveTofurtherunderstandpotentialmechanismofmiRNAsinbladdercancer.MethodsHumanmicroarraywasusedtoanalyzetheexpressionofmiRNAsinfourpairhumanBCcancertissuesandadjacentnormaltissues.ThenRT-qPCRwasusedtoverifiedthattheexpressionoftwomostup-regulatedmiRNAsandtargetgenesforresultsofmiRNA/mRNAmicroarray.Subsequently,itwasdeducedthatmiR-130b-3pcouldtargetatPTENthroughabioinformaticsapproachanddual-luciferasereporterassay.CCK8,EDU,flowcytometry,woundhealing,TranswellandcytoskeletonassaywereappliedtoprovethatmiR-130bcouldaffectproliferation,apoptosis,migrationandinvasionofBCcells.TheeffectsofPTENregulatedbymiR-130b-3ponthekeytargetproteinexpressionofPI3K/AKTandintegrin1/FAKsignalingpathwayweredeterminedbyWesternblot.ResultsmiR-130b-3pwassignificantlyup-regulatedandnegativelycorrelatedwithPTENexpressioninclinicalbladdercancerspecimensascomparedwithnormalurothelialtissue.miR-130b-3pmimicscoulddown-regulatePTENexpression,whichleadstotheactivationofPI3K/AKTandintegrin1/FAKsignalingpathwayrelatedtocellproliferation,migrationandinvasioninbladdercancerEJcells.WhenthecellsweretransfectedwithmiR-130b-3pinhibitors,theycouldbesur-veyedwithrearrangingcytoskeleton.ConclusionsmiR-130b/PTENmaybeusedasamarkerforbladdercancer.Keyword:
microarray;miR-130b-3p;PTEN;bladdercancer;Received:
2016-11-21每年約44萬例新增膀胱腫瘤患者,其中約15萬人死亡。
高復(fù)發(fā)率是膀胱癌的一個代表性特征。
目前,尚無任何目標分子被用于治療膀胱癌。
急需尋找具有改善臨床結(jié)果的新型治療靶標[1-2]。
microRNAs在膀胱癌的發(fā)病機制和發(fā)展中具有重要作用[3],其在腫瘤中明顯異常,并且可能參與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展[4-5]。
膀胱癌有效的生物標志物仍可被探索;miRNA似乎保持高度穩(wěn)定,提示應(yīng)用特定的miRNA可用于癌癥的診斷和治療[6]。
有報道表明miR-130家族在癌癥進展中的作用[7],但是miRNA/mRNA表達譜的聯(lián)合分析揭示miR-130-3p對腫瘤進展和發(fā)展,包括膀胱癌的作用迄今尚未見報道。
本研究揭示miR-130b-3p有望作為膀胱癌的診斷和治療的臨床標志物。
1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑:1.1材料1.1.1主要試劑:miR-130b-3p的模擬物及抑制劑(吉瑪公司);EDU試劑盒、pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報告載體(廣州銳博公司);雙熒光素酶檢測試劑盒及鬼筆環(huán)肽(Progema公司)。
培養(yǎng)基RPMI1640/DMEM1640(Gibico公司),轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000(Invitrogen公司)。
山羊抗兔抗體(Bioworld公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);CCK8試劑(鼎國公司);蛋白酶抑制劑(Sigma公司)。
1.1.2標本:接受放射治療或化療的患者(重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)。
從這些患者獲得知情同意書。
1.2方法1.2.1標本處理:1.2方法1.2.1標本處理:膀胱癌病理組織在手術(shù)后迅速置于液氮中,待芯片分析。
研究方案由重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會授權(quán)和監(jiān)督。
提取RNA進行后續(xù)檢測。
1.2.2芯片檢測:根據(jù)指導(dǎo)進行微陣列雜交,包括純化RNA,轉(zhuǎn)錄成熒光cDNA,然后雜交到人類lncRNA/mRNA陣列v3.0(Arraystar)和人類miRNA陣列v2.0(Arraystar)上。
通過分層聚類鑒定膀胱癌和配對的非腫瘤組織之間的mRNA和miRNA的統(tǒng)計學(xué)顯著差異表達。
通過篩選倍數(shù)變化2.0和1.5以及P值0.05,分別保留mRNA和miRNA的顯著差異表達的轉(zhuǎn)錄物。
1.2.3RT-qPCR檢測:RT-qPCR確認來自30個膀胱癌患者的微陣列數(shù)據(jù)。
根據(jù)制造商的方案,使用PrimeScriptReverseTranscriptase將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
通過使用SYBRGreen熒光染料進行RT-qPCR。
具體引物如下:hsa-miR-106b-3p:F:5’-CCGCACTGTGGGTACT-3’,R:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’hsa-miR-130b-3p:F:5’-GGGCAGTGCAATGATGAAA-3’,R:5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’。
PCR在10L反應(yīng)體積中進行,并由95℃3min的初始變性步驟組成,隨后在95℃5s和60℃30s的擴增40個循環(huán),然后在65℃至95℃進行熔解曲線步驟,并且在0.5℃下增量5s。
用比較閾值循環(huán)(2)方法計算基因表達。
1.2.4細胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染:將細胞在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中增殖,在37℃和5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
按照說明書,用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染細胞。
轉(zhuǎn)染后48h收獲細胞。
1.2.5雙熒光素酶報告實驗:將1.510個細胞/孔的HEK293T細胞種入96孔板。
根據(jù)說明書進行分組轉(zhuǎn)染。
使用雙熒光素酶報告測定系統(tǒng)測試熒光素酶活性。
1.2.6細胞增殖及凋亡實驗:細胞增殖實驗:細胞接種在96孔板中。
通過CCK-8每24或12h測量細胞吸光度值。
將含有10LCCK-8的新鮮培養(yǎng)基加入板中,細胞在37℃下培養(yǎng)2h。
在490nm處測吸光度,重復(fù)3次。
根據(jù)說明書,使用Cell-LightEduDNA試劑盒進行Edu分析。
細胞凋亡實驗:細胞轉(zhuǎn)染24h后收集細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡率,n=3。
1.2.7劃痕和細胞侵襲:將210個細胞/孔接種到6孔板中至80%匯合。
傷口用200L槍頭操作,更換無血清的RPMI1640培養(yǎng)基。
在0和24h用倒置相差顯微鏡拍攝照片,n=5。
用BD基質(zhì)膠侵襲小室進行細胞侵襲。
根據(jù)說明書進行操作,n=3。
1.2.8細胞骨架的檢測:細胞接種在24孔板中的蓋玻片上48h,用4%多聚甲醛固定30min,用0.3%TritonX-100處理5min,37℃下用3%BSA封閉30min。
將細胞與抗樁蛋白(1∶200稀釋)的抗體在4℃溫育過夜。
然后用二抗孵育1h,用1%鬼筆環(huán)肽-FITC在37℃處理40min并使用PBS漂洗35min。
然后,細胞用DAPI孵育10min,封片。
將細胞共聚焦顯微鏡下拍照。
1.2.9Westernblot檢測蛋白:將總細胞蛋白裂解物與含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液處理。
通過10%SDS來分離30g蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。
封閉后,將膜在4℃下與一抗(1∶500稀釋)溫育過夜。
將膜與山羊抗兔二級IgG(1∶2000稀釋)在37℃下孵育2h,發(fā)光顯色。
使用單克隆GAPDH(1∶2000)抗體作為內(nèi)參。
1.3統(tǒng)計學(xué)分析SPSS18.0和GraphPadPrism5.0統(tǒng)計軟件分析t檢驗的結(jié)果。
結(jié)果以均數(shù)標準差((s)表示。
2結(jié)果2.1異常表達的miRNA和mRNA異常表達的miRNA聚類圖(圖1A)。
mRNA芯片顯示了兩個最上調(diào)miRNA(hsa-miR-130b-3phsa-miR-106b-3p)的靶基因聚類圖(圖1B)。
2.2miR-130b-3p和miR-106b-3p表達上調(diào),PTEN和STC1表達下調(diào)miR-130b-3p和miR-106b-3p的表達上調(diào)(圖2A),其與芯片數(shù)據(jù)一致。
腫瘤抑制基因PTEN和STC1可能是miR-130b的潛在靶標(圖2B)。
與鄰近的非腫瘤組織相比,2種靶mRNA(PTEN和STC1)的表達均一致地下調(diào)(圖2C)。
PTEN比STC1與膀胱癌的相關(guān)性更高(圖3)。
用miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染的293T細胞的熒光素酶活性與對照組相比降低約64%(圖4)。
2.3miR-130b-3p影響膀胱癌細胞的增殖和凋亡增殖曲線與對照組相比,miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染的細胞活力增加(圖5A)。
通過Edu實驗獲得相似的結(jié)果(圖5B,E)。
約12.02%和15.3%的細胞在miR-130b-3p抑制劑組中出現(xiàn)凋亡。
而在對照細胞中約只有4.44%和6.79%的細胞顯示凋亡(圖5C)。
miR-130b-3p抑制劑細胞組出現(xiàn)代表性的形態(tài)凋亡特征,如核片段,凋亡體和染色質(zhì)濃縮,而對照細胞不出現(xiàn)凋亡性狀(圖5D)。
圖1通過芯片顯示異常表達的miRNA和mRNAFig1DifferentiallyexpressedmiRNAandmRNAprofilesarescreenedbymicroarray下載原圖EachcolumnrepresentsasampleandeachrowrepresentsamiRNAsormRNA;redstriprepresentshighrelativeexpressionandgreenstriprepresentslowrelativeexpression;Trepresentsbladdercancergroup,andNrepresentsnormalcontrolgroup;eachgroupcontainsfourdifferentsamples;A.heatmapofdifferentiallyexpressedmiRNAs(foldchange1.5andPvalue0.05);B.heatmapofco-expressedtargetmRNAsfromtwothemostupregulatedmiRNAs圖2異常表達的miRNA及其靶基因Fig2DifferentlyexpressedmiRNAandtargetgenes(xs,n=30)下載原圖A:therelativeexpressionlevelsofthe2miRNAsareshowninthirtypairsoftumortissues(T)andnormaltissues(N),*P0.05comparedwithN,n=30;B:theputativebindingsitesbetweenmiR-130b-3pandPTEN3’UTRorSTC13’UTR;C:therelativeexpressionlevelsofPTENandSTC1inthirtypairsoftumortissues(T)andnormaltissues(N),*P0.05comparedwithnormaltissuesgroup圖3利用Starbase功能預(yù)測軟件分析miR-130b的靶基因PTEN及STC1與膀胱癌的相關(guān)性分析Fig3miR-130btargetPTEN/STC1-cancerspearsoncorrelationanalysisaccordingtoStarbasefunctionprediction下載原圖圖4通過雙熒光素酶報告實驗驗證miR-130b-3p的靶基因PTENFig4TargetgenePTENofmiR-130b-3pisverifiedbydual-luciferasereporterassay((s,n=3)下載原圖Luciferaseactivityin293Tcellsco-transfectedmiR-130b-3pwithluciferasereporterscontainingPTEN3’UTRormutant,dataarepresentedastherelativeratioofhRluctohlucactivity,*P0.05comparedwithNCgroup圖5miR-130b-3p影響膀胱癌細胞的增殖與凋亡Fig5ThemiR-130b-3paffectsproliferationandapoptosisofbladdercancercells((s,n=3)下載原圖A:CCK8analysisofEJcellstransfectedwithmiR-130b-3pmimicsorscramblecontrol;B:representativeimagesofEduassayofEJcellstransfectedwithmiR-130b-3pmimicsorscramblecontrol,hoechststainsthenucleus(200);C:flowcytometryanalysiswithannexinV-PIstaining,thepercentageofapoptoticcellsinEJgroupstransfectedwithanti-130boranticon,respectively;D:representativenucleiimagesofHoechststaining(400);E:quantitativeEduassaydatain5fields,*P0.01comparedwithNCgroup2.4miR-130b-3p促進膀胱癌細胞的侵襲、遷移和重排細胞骨架上調(diào)miR-130b-3p顯著促進細胞的遷移和侵襲(圖6A~D)。
miR-130抑制劑能抑制應(yīng)激纖維形成和細胞中樁蛋白的表達。
相反,miR-130b-3p導(dǎo)致更豐富的肌動蛋白絲束和更亮的熒光信號(圖6E,F)。
2.5miR-130b-3p調(diào)節(jié)靶向PTEN的PI3K/AKT和整聯(lián)蛋白1/FAK信號通路上調(diào)miR-130b增加p-PI3K,p-Akt,p-FAK和整合素1的表達。
相反,當細胞用miR-130b-3p抑制劑轉(zhuǎn)染時,這些蛋白水平降低(圖7)。
3討論目前,尚無治療膀胱尿路上皮癌的分子靶標[8]。
但miRNAs提供了一種新的可用于癌癥的方法。
miRNA通過降解或抑制其靶基因的翻譯以實現(xiàn)其調(diào)節(jié)功能。
確定miRNA靶基因?qū)τ诹私鈓iRNA的作用非常重要[9]。
目前,全基因組篩選的miRNA通過聯(lián)合miRNA和mRNA表達譜在膀胱癌中闡明特定miRNA的功能尚未見報道。
通過整合mRNA/miRNA表達數(shù)據(jù)的芯片來找到miRNA和mRNA之間的新的調(diào)節(jié)關(guān)系。
近來,多個報告已經(jīng)顯示miR-130家族在癌癥進展中的影響,miR-130b在多種腫瘤中顯著失調(diào)[10-12]。
但miR-130b-3p分子對腫瘤進展的綜合作用,包括膀胱癌尚未被揭示。
芯片數(shù)據(jù)和qRT-PCR實驗證實在膀胱癌組織中miR-130b-3p上調(diào)且PTEN下調(diào)。
Silico分析,PTEN被預(yù)測為miR-130b的重要靶標。
通過一系列實驗來證明miR-130b可以直接結(jié)合到PTEN的3’-UTR序列并抑制其表達。
實驗結(jié)果也顯示miR-130b-3p促進了細胞增殖,遷移和侵襲以及骨架重排。
聯(lián)合mRNA和miRNA表達譜的研究為膀胱癌中miR-130b直接靶向PTEN而增加擴散和轉(zhuǎn)移提供了堅實的證據(jù)。
圖6miR-130b-3p促進膀胱癌細胞的侵襲、遷移及骨架重塑Fig6ThemiR-130b-3ppromotesinvasion,migrationandrearrangescytoskeletonofbladdercancercells((s,n=3)下載原圖圖7miR-130b-3p通過靶PTEN調(diào)節(jié)PI3K/AKT和整合素1/FAK信號途徑Fig7miR-130b-3pregulatesPI3K/AKTandintegrin1/FAKsignalingpathwaystargetingPTEN((s,n=3)下載原圖miR-130b-3p可能通過靶向PTEN激活PI3K/AKT和整合素1/FAK信號通路。
PTEN是PI3K/Akt信號通路的負調(diào)節(jié)劑,PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)元件已經(jīng)作為潛在的治療靶點而受到廣泛關(guān)注[13]。
miRNA和靶向mRNA的全基因組篩選揭示了miR-130b-3p在膀胱癌中對PTEN的負調(diào)節(jié)作用及對PI3K/AKT和整合素1/FAK信號通路。
本結(jié)果提示miR-130b有望作為膀胱癌診斷和治療的新型臨床標志物。
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