Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸分布的研究-0

1/1Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸分布的研究Cajal間質(zhì)細(xì)胞在先天性巨結(jié)腸分布的研究作者：

高穎曲政王磊陳新國(guó)古立暖王加勇【摘要】目的：

通過(guò)觀察cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitialcellsofcajal，ICC）在正常結(jié)腸及先天性巨結(jié)腸先天性巨結(jié)腸（hirschsprung’sdisease，HD）患者痙攣段、移行段、擴(kuò)張段的分布，探討HD的發(fā)病機(jī)制。

方法:收集25例HD患兒標(biāo)本，于術(shù)中分別選取擴(kuò)張段、移行段、痙攣段腸壁的全層組織，另取6例手術(shù)患兒的正常結(jié)腸全層組織標(biāo)本，常規(guī)固定石蠟包埋組織切片備用。

對(duì)標(biāo)本行c-Kit免疫組織化學(xué)染色。

光鏡觀察ICC的分布，計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

結(jié)果:正常結(jié)腸ICC主要分布在環(huán)肌內(nèi)側(cè)面與黏膜下層之間即黏膜下ICC（submucosalICC,ICC-SM）、環(huán)肌與縱肌之間的肌間神經(jīng)從周圍即肌間ICC（myentericICC，ICC-MY）以及環(huán)肌與縱肌內(nèi)。

HD患兒痙攣段ICC-SM、ICC-IM細(xì)胞數(shù)較擴(kuò)張段和正常對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)，且ICC的細(xì)胞突起的分支亦減少，彼此之間不能形成完整的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

而擴(kuò)張段ICC與正常對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

結(jié)論:HD患兒結(jié)腸ICC的異常分布，可能是HD發(fā)病、腸管蠕動(dòng)障礙以及排便異常的原因之一。

【關(guān)鍵詞】先天性巨結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞免疫組織化學(xué)【ABSTRACT】Objective：

Toinvestigatetheroleofinterstitialcellsofcajal（ICC）inthepathogenesisofHDthroughobservingthedistributionofthecellsinnormalcolonandHD’sdifferentsegments.Methods:Theaganglionic、transitionalanddilatedsegmentswerecollectedinoperationsfrom25childrenwithHirschsprungsdisease.Another6normalsegmengtswerealsocollected.Eachsectionswasstainedbyc-Kitimmunohistochemistry.ThedistributionoftheinterstitialcellsofCajalwasobservedbylightmicroscope.Results:TheICCinaganglionicsegmentsofcolonfromHirchsprungsdiseaseweredecreasedsignificantlyandstatisticallythanthatindilatedandnormalcolon.Moreover,wholemountpreparationsshowedthat,notonlythenumberofICC-IMwasdecreaseddown,butalsothebranchesofICC-IMandthecellularnetworkwerealsobrokendown.Conclusion:ThepathogenesisofHDisrelatedtotheabnormaldistributionofICC，whichleadtooraggravatethebowelspasminHD.【KEYWORDS】HirschsprungsdiseaseInterstitialcellsofCajalImmunohistochemistry先天性巨結(jié)腸（Hirschsprungsdisease,HD）是小兒普通外科常見(jiàn)病，由于病變腸段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，平滑肌過(guò)度收縮呈痙攣狀態(tài)，蠕動(dòng)消失，腸腔內(nèi)糞便不能通過(guò)痙攣部位，近端結(jié)腸繼發(fā)性擴(kuò)張，形成巨結(jié)腸，臨床上出現(xiàn)腸梗阻或便秘癥狀。

1893年西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家Cajal采用甲基藍(lán)及嗜銀染色法發(fā)現(xiàn)了存在于胃腸道的一種特殊類型的細(xì)胞,被稱為Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitialcellsofCajal，ICC）。

ICC是胃腸道運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞，具有自發(fā)性電活動(dòng)和產(chǎn)生傳播慢波等功能，對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。

ICC的變化與多種胃腸動(dòng)力疾病有關(guān)。

本研究通過(guò)c-Kit免疫組織化學(xué)染色，光鏡觀察ICC在正常結(jié)腸和巨結(jié)腸患者擴(kuò)張段、移行段、痙攣段的分布，探討ICC在HD致病中的作用。

1資料與方法1.1一般資料收集山東省立醫(yī)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2005年5月～2007年10月25例HD患兒手術(shù)切除組織，其中男22例，女3例。

平均年齡23個(gè)月，2周～3個(gè)月4例，3個(gè)月～3歲16例，gt;3歲5例。

長(zhǎng)段型2例，短段型2例，其余均為普通型。

所有病例綜合臨床表現(xiàn)、X線鋇劑灌腸和手術(shù)所見(jiàn)，并經(jīng)術(shù)中冰凍術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為HD，病例資料完整，均為散發(fā)。

手術(shù)切除的擴(kuò)張段、移行段、痙攣段全層腸壁組織經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，以擴(kuò)張段組織蠟塊作自身對(duì)照。

另取6例正常結(jié)腸組織作為對(duì)照，其中3例為乙狀結(jié)腸冗長(zhǎng)癥患兒切除的部分結(jié)腸組織，2例為腸扭轉(zhuǎn)腸壞死患兒切除的部分升結(jié)腸組織，1例為回盲型腸套疊患兒手術(shù)切除組織。

1.2主要試劑和方法兔抗人c-Kit多克隆抗體IgG，購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物抗體有限公司；SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

組織蠟塊行SP法免疫組織化學(xué)染色。

每個(gè)蠟塊連續(xù)切片3張，厚3～4m；切片常規(guī)脫蠟至水；3%過(guò)氧化氫去離子水室溫孵育5～10min；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，微波抗原修復(fù)。

正常山羊血清工作液封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗；滴加1:50稀釋的一抗，37℃孵育2h；PBS沖洗3次；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG二抗工作液，37℃孵育15min；PBS沖洗3次。

滴加PBS稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育15min；PBS沖洗3min，共3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。

以試劑盒附送陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3觀察指標(biāo)由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師在高倍鏡（400）下觀察全部病理切片的肌間、黏膜下各10個(gè)視野，了解ICC的分布情況并計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

HD擴(kuò)張段、痙攣段與對(duì)照組行成組設(shè)計(jì)兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，擴(kuò)張段與痙攣段之間行配對(duì)設(shè)計(jì)資料t檢驗(yàn)。

P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1不同結(jié)腸組織內(nèi)ICC的分布正常結(jié)腸組織內(nèi)可見(jiàn)兩類c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞：

一類細(xì)胞胞體較大，呈圓形，主要分布于黏膜層和黏膜下層，在肌層內(nèi)和漿膜下分布稀少，根據(jù)形態(tài)可識(shí)別為肥大細(xì)胞（圖1）。

另一類細(xì)胞胞體較小，呈梭形或多角形；細(xì)胞質(zhì)相對(duì)較多，可見(jiàn)棕色顆粒；核呈深藍(lán)色，圓形或橢圓形，此為ICC。

ICC細(xì)胞主要為多極細(xì)胞，少數(shù)為雙極細(xì)胞，細(xì)胞有2～3個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起，彼此借突起相互連接。

分布在縱肌與環(huán)肌之間的肌間神經(jīng)從周圍的ICC稱之為肌間ICC（myentericICC,ICC-MY)，細(xì)胞借突起形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)；位于黏膜下環(huán)形肌層表面的ICC稱之為黏膜下ICC（submucosalICC,ICC-SM)，細(xì)胞多為雙極細(xì)胞，借突起相互連接于黏膜下層和環(huán)肌層形成明顯的界面；分布在環(huán)肌、縱肌內(nèi)的ICC稱之為肌內(nèi)ICC（intramuscularICC,ICC-IM）,有的與平滑肌平行走行，有的與平滑肌交叉，數(shù)量較少，彼此之間未見(jiàn)相互連接（圖2）。

ICC在HD患兒病變結(jié)腸各段的分布不同。

擴(kuò)張段病變結(jié)腸c-Kit陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)與正常結(jié)腸無(wú)明顯差別，根據(jù)形態(tài)可識(shí)別肥大細(xì)胞和ICC。

ICC主要為ICC-MY和ICC-SM，彼此之間相互連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)或形成一界面，ICC-IM數(shù)量較少（圖3）。

痙攣段病變結(jié)腸c-Kit陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少,彼此之間的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)被破壞，ICC-SM亦明顯減少，彼此之間連接消失；ICC細(xì)胞形態(tài)與擴(kuò)張段和正常結(jié)腸相似，仍呈梭形或多角形（圖4）。

移行段病變結(jié)腸c-Kit陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量介于擴(kuò)張段與痙攣段之間。

2.2不同結(jié)腸組織內(nèi)ICC數(shù)量的比較正常結(jié)腸組織、HD擴(kuò)張段、HD痙攣段的ICC-MY數(shù)量分別為（13.172.17）、（11.123.28）、（2.161.70）；ICC-SM的數(shù)量分別為（6.561.18）、（8.332.16）、（1.881.56）。

正常結(jié)腸組織與HD擴(kuò)張段ICC-MY數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.0576,P=0.2990）；ICC-SM數(shù)量比較，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.7915,P=0.0837）。

正常結(jié)腸組織ICC-MY和ICC-SM數(shù)量均多于HD痙攣段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.4325,P＜0.01；t=8.4433,P＜0.01）。

HD擴(kuò)張段ICC-MY和ICC-SM數(shù)量均多于痙攣段，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.3165,P＜0.01；t=9.7783,P＜0.01）。

3討論HD是常見(jiàn)的小兒普通外科疾病，患兒胃腸道平滑肌過(guò)度收縮甚至痙攣，蠕動(dòng)消失，腸腔內(nèi)糞便滯留，近端結(jié)腸繼發(fā)性擴(kuò)張，形成巨結(jié)腸，臨床上主要表現(xiàn)為腸梗阻或便秘癥狀。

ICC是胃腸道運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞，對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)具有非常重要調(diào)節(jié)作用。

HD患兒多伴有病變結(jié)腸組織ICC的缺如。

既往應(yīng)用甲基藍(lán)和嗜銀染色、金屬摻合劑、NADPH黃遞酶染色以及碘化鋅四氧化鋨酸法對(duì)ICC進(jìn)行檢測(cè)，但這些方法均缺乏特異性。

真正的檢測(cè)依賴于顯微鏡，這在一定時(shí)期內(nèi)限制了對(duì)ICC的研究。

ICC的基因表達(dá)產(chǎn)物c-Kit可以作為一種化學(xué)標(biāo)志物與其他細(xì)胞區(qū)別開。

c-Kit是酪氨酸激酶受體，具有細(xì)胞外、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)3個(gè)部分［１］。

細(xì)胞外的部分為肝細(xì)胞因子（stemcellfactor，SCF）的受體區(qū),細(xì)胞內(nèi)部分為酪氨酸激酶區(qū)。

SCF與c-Kit結(jié)合活化了酪氨酸激酶,導(dǎo)致一系列磷酸化過(guò)程,從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。

人類腸道組織中c-Kit免疫組織化學(xué)染色僅能標(biāo)記兩種細(xì)胞，即肥大細(xì)胞和ICC。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常結(jié)腸組織內(nèi)c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞有較高的表達(dá)率，主要分布于肌間和黏膜下，密度明顯高于環(huán)肌與縱肌內(nèi)。

通過(guò)形態(tài)可以區(qū)別肥大細(xì)胞和ICC，肥大細(xì)胞較大呈圓形，具有圓形的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)豐富。

ICC呈梭形，多為多極細(xì)胞，少數(shù)為雙極細(xì)胞，具有卵圓形細(xì)胞核。

位于肌間的ICC彼此借突起相互形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，黏膜下的ICC連接形成一明顯的界面。

胃腸運(yùn)動(dòng)依賴神經(jīng)元、ICC和平滑肌細(xì)胞的正常功能。

ICC產(chǎn)生的基本電節(jié)律起關(guān)鍵作用。

ICC是胃腸慢波活動(dòng)的起搏器。

Koh等［２］將在分離培養(yǎng)的Balb/c小鼠的小腸ICC上用膜片鉗技術(shù)記錄到了有節(jié)律性、規(guī)則的慢波樣去極化波形，其波形與寬度均與胃腸道平滑肌肌條上記錄的慢波相似。

但小腸ICC與平滑肌細(xì)胞電生理特性不同，ICC在膜電位時(shí)即表現(xiàn)出自發(fā)性電壓振蕩（voltageoscillation），節(jié)律性電活動(dòng)不被超極化和L-型鈣通道阻滯劑所阻斷；而平滑肌細(xì)胞無(wú)自發(fā)性電活動(dòng)，僅表現(xiàn)為電壓敏感性動(dòng)作電位（voltagesensitiveactionpotential），可被超極化和L-型鈣通道阻滯劑抑制［３-４］。

結(jié)腸肌層ICC細(xì)胞培養(yǎng)電生理研究發(fā)現(xiàn)，ICC屬興奮型細(xì)胞，有自發(fā)性節(jié)律性電活動(dòng)，閾值明顯低于平滑肌細(xì)胞，推測(cè)ICC為胃腸電活動(dòng)的起搏細(xì)胞。

ICC也是腸神經(jīng)和平滑肌之間的中間媒介。

研究表明，腸肌叢ICC與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相聯(lián)系［５］。

ICC通過(guò)與平滑肌細(xì)胞的電藕聯(lián)關(guān)系，傳遞神經(jīng)沖動(dòng)。

ICC也能釋放某些神經(jīng)遞質(zhì)，如神經(jīng)肽，直接影響平滑肌細(xì)胞的相應(yīng)受體。

ICC與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞關(guān)系密切。

胚胎時(shí)期，ICC的分化和成熟需要c-Kit的配體，后者由神經(jīng)元或其他細(xì)胞產(chǎn)生。

本研究發(fā)現(xiàn)痙攣段肌間和黏膜下ICC數(shù)量較擴(kuò)張段和正常結(jié)腸明顯減少。

尚不清楚是由于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的減少引起了ICC的減少，或者相反，還是某種共同的因素導(dǎo)致了二者的同時(shí)減少。

目前研究認(rèn)為HD胚胎基質(zhì)的某種缺陷不僅損害了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的移行，也影響了ICC的分化和成熟，致使生后某段腸管神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，同時(shí)病變腸管ICC數(shù)量和ICC網(wǎng)絡(luò)異常，但具體的原因還不清楚。

劉浩等［６］研究c-Kit及SCF在兒童賁門失弛緩癥的分布，發(fā)現(xiàn)在遠(yuǎn)端食道及胃底部，c-Kit樣紡錘體型細(xì)胞的分布與對(duì)照組基本相同，但在賁門部明顯稀疏或缺如。

Watanabe等［７］研究發(fā)現(xiàn)，兒童賁門失弛緩癥與食管下端括約?。╨oweresophagealsphincter，LES）內(nèi)的ICC接受抑制性氮能神經(jīng)傳導(dǎo)減少有關(guān)。

慢性假性腸梗阻也被認(rèn)為與ICC的減少有關(guān)。

Jain等［８］發(fā)現(xiàn)慢性假性腸梗阻患者小腸壁c－Kit陽(yáng)性ICC消失。

慢傳輸型便秘的患者結(jié)腸ICC明顯減少，細(xì)胞體積縮小，包括縱肌層ICC（ICClongitudinalmuscle，ICC－LM）、環(huán)肌層ICC（ICCcircularmuscle，ICC－CM）等［９］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在正常結(jié)腸組織和HD擴(kuò)張段分布大量c-Kit陽(yáng)性ICC，彼此間借細(xì)胞突起相連接，在肌間形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，在黏膜下相互連接形成一明顯的界面，在環(huán)縱肌內(nèi)通過(guò)樹狀結(jié)構(gòu)與肌細(xì)胞相連。

ICC在神經(jīng)叢內(nèi)主要分布于外周，與平滑肌細(xì)胞緊密相連；在黏膜下邊緣與神經(jīng)叢伴行。

HD無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段腸壁內(nèi)c-Kit陽(yáng)性的ICC細(xì)胞數(shù)目明顯減少。

在痙攣段ICC形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)不明顯或消失，提示ICC之間及其與平滑肌細(xì)胞的電藕聯(lián)遭到破壞。

推測(cè)HD患兒ICC的正常功能遭到破壞，導(dǎo)致腸道運(yùn)動(dòng)功能紊亂，失去正常的蠕動(dòng)功能，從而使大便排出受阻，發(fā)生遠(yuǎn)端腸管痙攣狹窄和腸梗阻。

然而HD是一種多病因疾病，很多問(wèn)題不能用ICC缺如的單一因素解釋。

例如：

HD術(shù)后已經(jīng)切除至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞正常腸段，患兒為什么還存在小腸結(jié)腸炎、便秘、污糞等并發(fā)癥？是否還存在其他發(fā)生機(jī)制是否涉及其他與腸道運(yùn)動(dòng)相關(guān)的因素？這些問(wèn)題都有待于深入的研究。

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