GB∕ T 40170-2021 質(zhì)粒抽提及檢測通則（正式版）

GB/T40170—2021國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T40170—20211GB/T40170—2021質(zhì)粒抽提及檢測通則及廢棄物處理。本文件適用于質(zhì)粒的抽提及檢測。2規(guī)范性引用文件GB4789.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測通用要求和定義GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測GB/T34265Sanger法測序技術(shù)指南GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測紫外分光光度法3.1細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體(或擬核)以外的一個或多個閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子。3.2核糖核酸酶ARNaseA一種催化水解核糖核酸的核糖部分3'和5'磷酸二酯鍵，形成具有2',3'-環(huán)一磷酸衍生物寡聚核苷3.3由親水性的雜多糖和一個共價結(jié)合的類脂A組成的復(fù)合物。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)2GB/T40170—2021DNase:脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease)HPLC:高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)5一般性原則6抽提原理因組DNA等雜質(zhì)，經(jīng)異丙醇或乙醇沉淀DNA,最終得到純化質(zhì)粒。7抽提方法但不限于以下因素：——小分子質(zhì)量質(zhì)?？梢赃x用相對較劇烈的方法來分離；——具有限制性核酸內(nèi)切酶A的菌株建議采用酚-氯仿進(jìn)行抽提；——在細(xì)菌繁殖的對數(shù)生長期中期加入氯霉素可以增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。原理及特點(diǎn)見表1。表1幾種質(zhì)粒抽提原理及特點(diǎn)方法原理特點(diǎn)硅膠柱法高鹽條件下，硅膠與DNA分子有高親和力，低鹽或雙蒸水洗脫DNA適用于高通量質(zhì)粒小量抽提磁珠法采用一種納米磁珠微珠材料，該磁珠經(jīng)硅羥基修飾后，DNA分子可與之發(fā)生特異性結(jié)合適用于微量樣品的提取，效率高，便于自動化操作酚-氯仿法酚使蛋白質(zhì)變性并抑制DNase活性，氯仿去除過量酚、利于有機(jī)相與液相分層，異丙醇具有強(qiáng)疏水作用，用于質(zhì)粒三級結(jié)構(gòu)完整，適用于高質(zhì)量質(zhì)粒抽提3表1(續(xù))方法原理特點(diǎn)離子交換法低鹽低pH條件下，DNA與離子交換劑結(jié)合，高鹽高pH條件下洗脫DNA適用于大規(guī)模質(zhì)粒抽提，超螺旋比例高硅膠柱法抽提操作步驟按照商業(yè)吸附柱抽提試劑盒說明書進(jìn)行。磁珠吸附法抽提操作步驟按照商業(yè)磁珠法抽提試劑盒說明書進(jìn)行。酚-氯仿法抽提操作步驟按照附錄A進(jìn)行。離子交換法抽提操作步驟按照附錄B進(jìn)行。8檢測8.1檢測項(xiàng)目方法。8.3檢測方法按照GB/T34796執(zhí)行，參考結(jié)果見附錄C。4GB/T40170—2021按照GB/T34796執(zhí)行，OD??o/ODs0在1.8至2.0之間，OD?so/OD??0在2.0至2.5之間，瓊脂糖凝采用高效液相色譜法檢測質(zhì)粒超螺旋比例，利用超螺旋質(zhì)粒和RNA,基因組DNA碎片的疏水性質(zhì)的差異，將待測樣超螺旋質(zhì)粒和其余DNA、RNA分離。方法、設(shè)備運(yùn)行參數(shù)按照附錄D執(zhí)行，根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算目標(biāo)峰面積占所有峰面積的比值。參考結(jié)果見附錄C。不消失。參考結(jié)果見附錄C。采用鱟試劑檢測法檢測細(xì)菌內(nèi)毒素，檢測方法見中華人民共和國藥典：2020年版.四部，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。參考結(jié)果見附錄C。按照GB4789.3中的大腸菌群計(jì)數(shù)-平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行，同時以涂布生理鹽水平板為對照，無菌落生長。參考結(jié)果見附錄C。9質(zhì)量控制涉及質(zhì)粒抽提及檢測的技術(shù)人員應(yīng)該完全了解菌種培養(yǎng)的相關(guān)工作，應(yīng)掌握質(zhì)粒檢測等相關(guān)理論知識和相關(guān)試驗(yàn)基礎(chǔ)?！莆召|(zhì)粒分子生物學(xué)特性；——定期進(jìn)行人員的測量能力考核。檢測儀器應(yīng)符合預(yù)期要求的性能參數(shù)和規(guī)格。儀器設(shè)備的使用應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行操作。主要分析設(shè)備的操作規(guī)程應(yīng)制定得詳細(xì)、清楚。定期對儀器設(shè)備進(jìn)行檢測或校準(zhǔn)。5GB/T40170—2021檢測試劑應(yīng)嚴(yán)格按照使用方法正確使用。檢測試劑的使用應(yīng)具有嚴(yán)格的文件記錄制度，包括試劑的標(biāo)識、使用時間等信息。9.4實(shí)驗(yàn)室通用要求實(shí)驗(yàn)室DNA污染一般來源于氣溶膠。因此，質(zhì)粒抽提和檢測以及實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域的組織及良好的試驗(yàn)操作應(yīng)基于：質(zhì)粒貯存于—20℃冰箱，避免反復(fù)凍融。長期保存建議放置一80℃超低溫冰箱。b)總量；f)OD??/OD230;i)基因組DNA殘留；j)細(xì)菌檢測；12廢棄物處理廢棄物處理按照GB/T27403和GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。6GB/T40170—2021(規(guī)范性)A.1試驗(yàn)試劑A.1.1葡萄糖(Glucose,C?H?2O?)。A.1.2三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM,Tris,C?H??NO?]。A.1.3鹽酸(Hydrochloricacid,HCl)。A.1.5核糖核酸酶A(RNaseA)。A.1.6氫氧化鈉(Sodiumhydroxide,NaOH)。A.1.7十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate,SDS,C2H?5SO?Na)。A.1.9冰醋酸(AceticAcid,CH?COOH)。A.1.11乙醇(Ethanol,C?H?O)。A.1.12異丙醇(Isopropanol,C?H?O)。A.1.13苯酚(Phenol,C?H?OH)。A.1.16磁珠懸浮液(內(nèi)含特異性吸附質(zhì)粒的磁珠)。A.1.17溶液1(pH8.0):50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl,10mmol/LEDTA,100μg/mLRNaseA。A.1.18溶液2:200mmol/LNaOH,1%SDSA.1.20BufferW2:20mmol/LTris-Cl,75%乙醇。A.1.2275%乙醇溶液(C?H?OH)。A.2操作步驟A.2.1分步收集2mL～4mL菌液到2mL離心管中，12000r/min,離心1min,棄上清。A.2.2向離心管中加入250μL溶液1(已加入RNaseA),渦旋振蕩使細(xì)胞重懸。A.2.4向離心管中加入350μL溶液3,溫和翻轉(zhuǎn)離心管6次～10次，此時可觀察到管內(nèi)出現(xiàn)白色絮狀物，12000r/min室溫離心10min。7GB/T40170—2021A.2.9小心棄去上清。8GB/T40170—2021(規(guī)范性)離子交換法B.1試驗(yàn)試劑B.1.1葡萄糖(Glucose,C?H2O?)。B.1.2三羥甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethaneTHAM,Tris,C?HNO?]。B.1.3鹽酸(Hydrochloricacid,HCl)。B.1.5核糖核酸酶A(RNaseA)。B.1.6氫氧化鈉(Sodiumhydroxide,NaOH)。B.1.7十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate,SDS,C??H??SO?Na)。B.1.8醋酸鉀(Potassiumacetate,CH?COOK)。B.1.9冰醋酸(AceticAcid,CH?COOH)。B.1.10鹽酸胍(GuanidineHydrochloride,Gu-HCI,CH?ClN?)。B.1.11乙醇(Ethanol,C?H?O)。B.1.12氯化鈉(Sodiumchloride,NaCl)。B.1.133-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS,C?H??NO?S)。B.1.14聚乙二醇辛基苯基醚[TritonX-100,C??H??O(C?H?O)n]。B.1.15異丙醇(Isopropanol,C?H?O)。B.1.16BufferP1(pH8.0):50mmol/LTris-Cl,10mmol/LEDTA,100μg/mLRNaseA。B.1.17BufferP2:200mmol/LNaOH,1%SDS。B.1.18BufferP3(pH5.5):3mol/L醋酸鉀。B.1.19BufferQBT(pH7.0):750mmol/LNaCl,50mmol/LMOPS,0.15%TritonX-100。B.1.20BufferQC(pH7.0):1.0mol/LNaCl,50mmol/LMOPS,15%異丙醇。B.1.21BufferQF(pH8.5):1.25mol/LNaCl,50mmol/LMOPS,15%異丙醇。B.1.22TE溶液(pH8.0):10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA。B.2.3收集B.2.2中菌液于500mL離心B.2.4棄上清，并倒扣在吸水紙上，加入30mL,4℃預(yù)冷的BufferP1(已加入RNaseA),反復(fù)吹打沉淀直至完全混勻。B.2.5加入30mL細(xì)胞裂解液BufferP2,輕柔地上下顛倒混勻4次～6次，在室溫下孵育時間不要超過5min。B.2.6加入30mL預(yù)冷的BufferP3,立即顛倒混勻6次～8次(動作要輕柔),在冰上孵育10min,4℃,8000g離心20min。B.2.7在層析柱的頂端加濾紙，沿濾紙邊緣緩慢加入20mL的BufferQBT(平衡層析柱)。B.2.8將B.2.6中的上清小心移到層析柱中(不可將沉淀繞動),讓液體自由流下。9B.2.9加入20mLBufferQC清洗層析柱一次。B.2.10加入20mLBufferQF洗脫DNA,準(zhǔn)備對應(yīng)的50mL的離心管分別收集洗脫液。B.2.15重復(fù)B.2.14。GB/T40170—2021(資料性)質(zhì)粒檢測參數(shù)及參考結(jié)果質(zhì)粒檢測參數(shù)及參考結(jié)果見表C.1。表C.1質(zhì)粒檢測參數(shù)及參考結(jié)果一覽表檢測項(xiàng)目參考結(jié)果液體外觀肉眼觀察清澈、透明序列驗(yàn)證與目標(biāo)序列一致，100%正確濃度檢測純度檢測OD?60/OD?302.0～2.5有無其他雜帶無超螺旋比例大于或等于80%瓊脂糖凝膠電泳不可見殘余基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳不