金屬離子對纖維素酶降解汽爆秸稈的影響

金屬離子對纖維素酶降解汽爆秸稈的影響摘要：以汽爆秸稈為底物，分別考察添加Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋和Ｆｅ３＋四種金屬離子對纖維素酶解性能的影響。結(jié)果表明，金屬離子的種類、用量均會影響纖維素的酶解效率。其中Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋對纖維素降解有促進(jìn)作用，當(dāng)Ｆｅ２＋濃度為０．６ｍｇ／ｍＬ時，對纖維素降解促進(jìn)作用最明顯。Ｍｇ２＋和Ｆｅ３＋則會抑制纖維素酶解?？疾炝死w維素酶在水解過程中的吸附過程，添加Ｆｅ２＋可加快纖維素酶的吸附，促進(jìn)纖維素酶與纖維素的有效結(jié)合。

關(guān)鍵詞 ：纖維素酶；金屬離子；水解；激活；吸附

中圖分類號：Ｑ８１４．９文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0439－８114（２０15）03－05４６-0４

纖維素是一種可再生資源，它來源于農(nóng)業(yè)廢棄物如稻草、稻殼、麥稈等，木材廢棄物如木屑、樹皮以及城市廢棄物等。全國每年僅農(nóng)作物秸稈約有７億ｔ，其中作為農(nóng)村燃料消耗２億ｔ。若將其余５億ｔ用來生產(chǎn)纖維素乙醇，可產(chǎn)乙醇７０００萬ｔ，若再加上木材工業(yè)下腳料、制糖造紙工業(yè)下腳料和城市廢纖維垃圾等，纖維素乙醇的生產(chǎn)原料非常豐富，生產(chǎn)潛力巨大。目前，生物乙醇主要用于制備乙醇汽油。生物乙醇還將廣泛應(yīng)用于燃料電池市場，作為燃料電池動力的主要來源。此外，乙醇是生產(chǎn)乙烯的理想原料，隨著石油資源的枯竭，乙醇必將代替石油成為乙烯工業(yè)的主要原料，在化學(xué)合成工業(yè)上發(fā)揮巨大的作用。因此，無論從短期的燃料市場來看，還是從長期的化纖合成工業(yè)來分析，生物乙醇都將擁有廣闊的市場前景，是發(fā)展?jié)摿薮蟮木G色能源［１－３］。

木質(zhì)纖維素水解是纖維素乙醇的關(guān)鍵技術(shù)之一。利用纖維素酶進(jìn)行纖維素水解，可以避免酸水解工藝的高溫高壓苛刻條件，也可以防止對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕，但其缺點(diǎn)是反應(yīng)速度慢、生產(chǎn)周期長、酶成本高。因此，設(shè)法提高纖維素酶的活力可以提高轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本。目前報道較多的金屬離子對纖維素酶的影響基本都采用游離酶作為考察對象，沒有涉及到反應(yīng)體系中的酶，對實(shí)際應(yīng)用意義不大［４－８］。本研究考察纖維素水解過程中金屬離子的調(diào)控效應(yīng)，以期提高纖維素酶的利用率。

１材料與方法

１．１材料

汽爆秸稈由三峽大學(xué)材料與化工學(xué)院實(shí)驗室提供。

１．２方法

１．２．１汽爆秸稈的處理用８０℃左右的熱水蒸煮汽爆秸稈，洗去其中含有的糠醛等雜質(zhì)，將濾渣收集并烘干，用研缽研碎并過４０目篩。處理完成后，用密封袋貯藏。

１．２．２金屬離子對汽爆秸稈水解的影響準(zhǔn)確稱取過篩后汽爆秸稈渣１０ｇ和０．３５ｇ纖維素酶置于２５０ｍＬ錐形瓶中，加入１００ｍＬｐＨ４．８的乙酸－乙酸鈉緩沖液充分?jǐn)嚢?，添加不同種類、濃度的金屬離子，于５０℃恒溫振蕩水?。矗福?，測還原糖含量，計算水解率。

１．２．３金屬離子對酶與底物吸附的影響每隔０、５、１０、１５、３０、６０、９０ｍｉｎ吸取水解液２ｍＬ于離心管中，１００００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ。取上清液適當(dāng)稀釋后測蛋白質(zhì)含量。溶液中初始蛋白質(zhì)含量與濾液中蛋白質(zhì)含量之差即為吸附的蛋白質(zhì)含量。

１．２．４測定方法還原糖的測定采用ＤＮＳ法［９］。纖維素酶活性測定采用濾紙酶活法［１０］，即ｐＨ４．８、５０℃下１ｇ固體酶１ｈ內(nèi)水解濾紙生成１ｍｇ的葡萄糖為一個濾紙酶活單位（ＦＰＡ）。蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法［８］。所有的數(shù)據(jù)測定做２個平行樣，取平均值。纖維素結(jié)構(gòu)測定：將水解４８ｈ后的水解液抽濾，收集濾渣，置于烘箱中干燥。干燥后用密封袋儲存樣品，待進(jìn)行紅外光譜檢測。紅外分析采用ＫＢｒ壓片法，掃描范圍４０００～４００ｃｍ－１。

２結(jié)果與分析

２．１Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋對汽爆秸稈酶解的影響

由圖１、圖２可知，在Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋濃度分別為０．４、０．８、１．２、１．６ｍｇ／ｍＬ的情況下，隨著水解時間的增加，汽爆秸稈的水解率逐漸增大，在相同的水解時間里，與對照組相比，加入Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋的濃度越大，水解率越低。這說明Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋對纖維素酶解有抑制作用，且隨金屬離子濃度的增大，抑制作用越明顯。Ｆｅ３＋的抑制作用可能是由于Ｆｅ３＋的存在不利于底物與酶的活性中心相結(jié)合；Ｍｇ２＋的抑制機(jī)理與Ｆｅ３＋的抑制機(jī)理相似［１１－１２］。

２．２Ｆｅ２＋對汽爆秸稈酶解的影響

如圖３所示，隨水解時間增加，汽爆秸稈的水解率逐漸增大，在相同的水解時間里，與對照組相比，當(dāng)加入Ｆｅ２＋濃度為０．２ｍｇ／ｍＬ時，其水解率較低，當(dāng)加入Ｆｅ２＋濃度為０．４、０．６ｍｇ／ｍＬ時，水解率增大，且０．６ｍｇ／ｍＬＦｅ２＋對汽爆秸稈的水解促進(jìn)作用最強(qiáng)，當(dāng)Ｆｅ２＋濃度繼續(xù)增大到１．０ｍｇ／ｍＬ，水解率反而降低。這種現(xiàn)象可能是由于當(dāng)Fe2+濃度較低時，F(xiàn)e2+在酶與底物之間起了連橋作用，形成了Ｅ－Ｍ－Ｓ復(fù)合物。從而更有利于底物與酶的活性中心必需基團(tuán)的結(jié)合，因而使酶活力得到提高。而當(dāng)離子濃度過高時，激活作用逐漸減弱，甚至呈現(xiàn)抑制作用。

２．３Ｃｕ２＋對汽爆秸稈酶解的影響

如圖４所示，與對照組相比，在水解相同的時間里，當(dāng)加入Ｃｕ２＋濃度為０．２、０．６、１.0ｍｇ/ｍＬ時，水解率都有所增加，其中Ｃｕ２＋濃度為０．６ｍｇ/ｍＬ時，水解率增加最大，而當(dāng)Ｃｕ２＋濃度增加為１．４ｍｇ/ｍＬ，水解率變化不大，若Ｃｕ２＋濃度繼續(xù)增大，可能會抑制纖維素水解。低濃度的Ｃｕ２＋對酶解過程的促進(jìn)作用可能是由于Ｃｕ２＋的存在更有利于底物與酶的活性中心相結(jié)合，從而使酶活力得到提高，水解率也相應(yīng)增大。而當(dāng)其濃度增大到一定值，由于Ｃｕ２＋的重金屬作用，使蛋白質(zhì)變性，酶逐漸失活，對酶解過程產(chǎn)生抑制作用。

２．４金屬離子對纖維素酶吸附的影響

纖維素的酶水解是固液非均相反應(yīng)，纖維素酶首先擴(kuò)散到底物纖維素的表面被吸附，然后將纖維素水解為可發(fā)酵糖［１３］。纖維素酶的吸附存在平衡狀態(tài)，即吸附達(dá)到一定程度后，吸附量達(dá)到飽和。研究表明，纖維素酶在纖維上的吸附平衡時間約３０～６０ｍｉｎ［１４，１５］。因此，纖維素酶對纖維素的可及性是決定水解起始速率的關(guān)鍵因素。為探討金屬離子對纖維素降解的影響機(jī)制，比較加入金屬離子后對纖維素酶吸附的影響情況。水解過程中反應(yīng)體系內(nèi)蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果如圖５所示。由圖５可見，隨著纖維素水解反應(yīng)的進(jìn)行，水解液中蛋白質(zhì)含量先增大后逐漸減小，在３０ｍｉｎ后水解液中蛋白質(zhì)含量幾乎不變。這表明在反應(yīng)剛開始階段，由于汽爆秸稈中原含有一定量的蛋白質(zhì)，隨著振蕩，這些蛋白質(zhì)逐漸溶解到反應(yīng)液中，使得水解液蛋白質(zhì)含量增加，而之后蛋白質(zhì)含量又迅速下降，這表明纖維素酶開始吸附到纖維素中，到３０ｍｉｎ左右達(dá)到吸附平衡。添加Fe2+后，加快了纖維素酶的吸附速度，使纖維素酶易于吸附到纖維素中，這也與加入０．６ｍｇ／ｍＬＦｅ２＋能夠提高汽爆秸稈水解率的結(jié)果相符，說明Fe2+可以促進(jìn)底物與酶的結(jié)合。

２．５不同水解條件下纖維素結(jié)構(gòu)變化

由以上的研究了解到Ｆｅ２＋對纖維素水解有一定的促進(jìn)作用。采用有機(jī)溶劑處理的方法脫除汽爆秸稈的木質(zhì)素，然后添加Ｆｅ２＋，發(fā)現(xiàn)其水解率可以達(dá)到４６．６％。分別將汽爆秸稈、汽爆秸稈添加Ｆｅ２＋和脫木質(zhì)素的汽爆秸稈添加Ｆｅ２＋水解以后得到的殘渣進(jìn)行紅外光譜分析，得到的圖譜如圖６。圖譜Ｂ、Ｃ與Ａ比較可知，３３５０ｃｍ－１、２９０６ｃｍ－１處的振動峰增強(qiáng)，說明有更多的纖維素的β－１，４葡萄糖苷鍵斷裂，降解為還原糖，與水解率研究的結(jié)果一致，添加Ｆｅ２＋對于纖維素和脫除木質(zhì)素的纖維素的水解都有促進(jìn)作用。不同處理條件下，纖維素樣品的紅外光譜圖相似，只是部分吸收峰的強(qiáng)度發(fā)生了變化，證明沒有新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能性基團(tuán)生成，試樣的主體化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化。有文獻(xiàn)［１６－１８］表明，纖維素酶的吸附與木質(zhì)素有關(guān)，從紅外圖譜C上得知，木質(zhì)素特征吸收峰（1505cm-1）減弱較明顯，木質(zhì)素被脫除，但添加Ｆｅ２＋后脫木質(zhì)素纖維素水解率較之未脫木質(zhì)素仍有較大幅度提高，其促進(jìn)作用可能源于金屬離子導(dǎo)致纖維素酶蛋白的空間構(gòu)象變化，從而影響其生物活性。

３結(jié)論與討論

不同金屬離子在不同濃度下對汽爆秸稈酶解過程有不同程度的抑制或促進(jìn)作用。Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋在一定濃度范圍內(nèi)對酶解過程有一定的促進(jìn)作用，Ｆｅ３＋和Ｍｇ２＋則會抑制纖維素酶解過程。其中，Ｆｅ２＋的促進(jìn)作用最明顯，在ｐＨ４．５、汽爆秸稈１０ｇ，酶活性１２ＦＰＵ／ｇ，Ｆｅ２＋濃度０．６ｍｇ／ｍＬ的１００ｍＬ溶液５０℃酶解４８ｈ后，纖維素的水解率比不添加金屬離子的提高１８．６０％，采用脫除木質(zhì)素的汽爆秸稈，其水解率可以達(dá)到４６．６％。底物中木質(zhì)素含量越低，金屬離子對纖維素轉(zhuǎn)化率的提高幅度也越大，通過考察添加Ｆｅ２＋后纖維素對纖維素酶吸附的情況以及對水解后纖維素渣的紅外光譜分析，表明Ｆｅ２＋能在一定程度上促進(jìn)纖維素酶與底物纖維素的有效結(jié)合，從而對酶解過程起到促進(jìn)作用。

此次研究了不同金屬離子在酶催化反應(yīng)體系中對纖維素酶活性的影響，其結(jié)果與游離酶的影響趨勢以及他人的研究結(jié)果不盡一致，可能的原因為設(shè)定的離子濃度不同或者作為不同來源的纖維素酶激活劑的特定金屬離子也不同，因而，同種離子對不同來源的纖維素酶活性的影響以及金屬離子對纖維素酶活性影響的機(jī)理等尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［１］彭姿，譚興，熊興耀，等．木質(zhì)纖維素糖化前預(yù)處理新技術(shù)研究進(jìn)展［Ｊ］．中國釀造，２０１３，３２（１）：１－４．

［２］陳洪章，邱衛(wèi)華．秸稈發(fā)酵燃料乙醇關(guān)鍵問題及其進(jìn)展［Ｊ］．化學(xué)進(jìn)展，２００７，１９（７／８）：１１１６－１１２１．

［３］ＭＡＥＤＡＲＮ，ＢＡＲＣＥＬＯＳＣＡ，ＡＮＮＡＬＭＭＳ，ｅｔａｌ．ＣｅｌｌｕｌａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｓｕｇａｒｃａｎｅｂａｇａｓｓｅｆｏｒｓｅｃｏｎｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｅｔｈａｎｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｂｙｆｅｄｂａｔｃｈｏｐｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，2024，163（1）：３８－４４．

［４］馮培勇，常迪，楊立紅．一株綠色木霉產(chǎn)纖維素酶的性質(zhì)研究［Ｊ］．食品科學(xué)，２００６，２７（１２）：１８５－１８７．

［５］安剛，陶毅明，龍敏南，等．金屬離子對白蟻纖維素酶活力的影響［Ｊ］．廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），２００８，４７（２）：１０７－１０９．

［６］張紅娟，岳淑寧，張強(qiáng)，等．金屬離子對４ＰＣＡ飼料酶中纖維素酶活性的影響［Ｊ］．技術(shù)與市場，２００８（１２）：６－７．

［７］管國強(qiáng)，何林富，張志才，等．金屬離子對靈芝纖維素酶和木聚糖酶活性的作用［Ｊ］．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，２００８，２０（６）：２７－３０．

［８］包曉峰．纖維素酶降解生物質(zhì)生物活性研究及金屬離子對纖維素酶活力的影響［Ｄ］．南京：南京理工大學(xué)，２００２．

［９］董曉燕．生物化學(xué)實(shí)驗［Ｍ］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，２００３．

［１０］劉潔，李憲臻，高培基．測定纖維素酶活力方法評述［Ｊ］．工業(yè)微生物，１９９４，２４（４）：２７－３２．

［１１］張洪鑫，陳小泉，蔣玲玲．金屬離子對纖維素酶內(nèi)切酶和外切酶活性的影響［Ｊ］．纖維素科學(xué)與技術(shù)，２０１１，１９（４）：６－１３．

［１２］王娜娜，姚秀清，張全，等．金屬離子及表面活性劑對纖維素酶水解預(yù)處理玉米秸稈的影響［Ｊ］．科學(xué)技術(shù)與工程，２０１１，１１（２０）：４９１３－４９１６．

［１３］詹小明，夏黎明．纖維素酶在玉米芯上的吸附及其水解作用［Ｊ］．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，２００５，２５（３）：７６－８０．

［１４］ＬＹＮＤＬＲ，ＷＥＩＭＥＲＰＪ，ＶＡＮＺＹＬＷＨ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓａｎｄｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，２００２，６６（３）：５０６－５１５．

［１５］ＴＵＭＢ，ＣＨＡＮＡＤＲＡＲＰ，ＳＡＤＤＬＥＲＪＮ．ＲｅｃｙｃｌｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｓｅｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｓｔｅａｍｅｘｐｌｏｄｅｄａｎｄｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｔｒｅａｔｅｄＬｏｄｇｅｐｏｌｅｐｉｎｅ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒｅｓｓ，２００７，２３（５）：１１３０－１１３７．

［１６］ＢＯＲＪＥＳＳＯＮＪ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙ