常用分子生物學技術RNA干擾技術省公開課一等獎全國示范課微課金獎課件

藥學分子生物學張徐江蘇大學醫(yī)學院分子生物學及檢驗教研室xuzhang@1/39生物芯片（biochip）以生物、電子、機械和信息技術為基礎，在固相支持物表面建立集成、連續(xù)、微型分析系統(tǒng)，形成芯片，實現(xiàn)對生物大分子準確、快速、高通量、自動化檢測。2/39基因芯片（genechip）將大量探針有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探針，然后與標識待測核酸樣品進行雜交，經(jīng)過對探針雜交信號強度分析來獲知樣品中對應靶分子數(shù)量和序列信息。3/39基因芯片工作原理：核酸分子雜交1.芯片制備基因芯片檢測步驟：2.樣品準備和標識3.分子雜交4.信號檢測5.數(shù)據(jù)處理分析4/39蛋白質芯片

（proteinchip）將蛋白質有序固定于載體上制備芯片，然后用標識蛋白質或其它成份與芯片作用，洗去未結合成份，再檢測芯片上熒光強度，來分析蛋白質間或蛋白質與其它分子之間相互作用關系。5/39將不一樣生物體組織標本按預先設計次序排列在固相載體上形成組織微陣列，是一個高通量、多樣本分析工具。

組織芯片

（tissuemicroarray）6/39用人工方法測定并分析核酸堿基組成及排列次序，即測定核酸一級結構。第一代測序技術：鏈末端終止法

(Sanger法，雙脫氧鏈終止法)核酸測序（sequencingofnucleicacids）7/39雙脫氧鏈終止法測序以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，在測序引物引導下，DNA聚合酶介導體外合成互補DNA。雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP）為鏈終止子（4組1套反應），合成四組有序列梯度互補DNA。高分辨電泳分離新合成DNA，依據(jù)產物大小識讀堿基排列次序，最終轉換為待測模板核酸序列。基本原理8/39雙脫氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP)9/39測序模板序列5’TCAGCTCGAATC10/39第六章慣用分子生物學技術第一節(jié)聚合酶鏈反應第二節(jié)分子雜交技術第三節(jié)基因敲除技術第四節(jié)RNA干擾技術第五節(jié)基因組編輯技術第六節(jié)分子相互作用技術11/39RNA干擾技術雙鏈RNA能高效、特異性地誘導同源mRNA降解，從而緘默基因表示，稱為RNA干擾（RNAinterference,RNAi），也稱轉錄后基因緘默。1990年，在轉基因牽?；ㄖ杏^察到共抑制現(xiàn)象12/39RNA干擾（RNAinterference,RNAi）1998年，AndrewFire和CraigMelo首次將正義鏈和反義鏈RNA混合后，注入線蟲（C.elegans），觀察到更強基因表示抑制作用，據(jù)此提出RNA干擾概念。A.未染色組;B.正常對照組C.反義RNA組;D.正義+反義RNA組13/39

年，首次報道在哺乳動物細胞中，經(jīng)過21個核苷酸大小siRNA誘導特異性基因緘默。14/39安德魯·菲爾&克雷格·梅洛發(fā)覺“RNA干擾機制”，獲年諾貝爾醫(yī)學獎15/39RNA干擾機制（1）siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）（2）RNA誘導緘默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）形成（3）RISC

活化：siRNA解旋成為單鏈，無活性RISC轉變成活性形式（包含siRNA反義鏈）（4）誘導靶mRNA降解：在siRNA反義鏈引導下，RISC識別并切割與siRNA反義鏈互補靶mRNA（5）dsRNA再生成16/39RNA干擾機制17/39

siRNA（小干擾RNA）：21-23nt，由dsRNA裂解而成小片段，可誘導mRNA降解。siRNA主要參加抵抗外源性病毒核酸侵染。RNA干擾（RNAinterference,RNAi）

miRNA（微小RNA）：約22nt，由miRNA前體剪切而成，可抑制mRNA翻譯。miRNA主要參加內源性基因表示調整。18/3919/39siRNA(小干擾RNA)

miRNA(微小RNA)起源siRNA是外源性，是RNA干擾中間產物miRNA是內源性，是生物體固有結構siRNA是雙鏈RNAmiRNA是單鏈RNADicer酶加工過程對稱地起源于雙鏈RNA不對稱加工，僅剪切miRNA側臂作用位置siRNA可作用于mRNA任何部位miRNA主要作用于mRNA

3′端非翻譯區(qū)（3’-UTR）作用方式siRNA普通造成靶mRNA降解，即為轉錄水平后調控。miRNA可抑制靶mRNA翻譯，也能夠造成靶mRNA降解，即在轉錄后水平和翻譯水平起作用作用階段siRNA不參加生物生長，主要作用是抑制病毒感染miRNA主要調整內源基因表示，在發(fā)育過程中起作用20/39RNA干擾技術實施策略1、體外合成siRNA采取化學合成法來直接合成靶向目標基因siRNA，再經(jīng)過不一樣方法導入細胞。2、siRNA表示載體介導依據(jù)siRNA序列設計DNA片段，插入表示載體中，導入細胞，轉錄出shRNA，深入切割形成siRNA。21/39體外合成siRNA22/39短發(fā)卡RNA（shRNA）siRNA表示載體介導正義鏈反義鏈--------CUGAGGUCACCAUUAGAUG-----------靶mRNA23/39RNA干擾技術特點1、RNA干擾技術優(yōu)點（1）含有較高特異性（2）基因緘默效率較高2、RNA干擾技術缺點

“脫靶效應”（off-targeteffects）24/39RNA干擾技術應用2、基因治療（基因失活性治療）（1）病毒感染性疾病

經(jīng)過RNAi抑制

RNA病毒復制1、基因功效研究（功效失活策略）（2）基因過表示引發(fā)疾?。ㄈ缒[瘤）

siRNA藥品“基因敲減（knockdown）”25/3926/39基因打靶（genetargeting）利用同源重組原理對細胞特定內源基因進行改造技術。27/3928/39基因敲除（geneknockout）：宿主基因組中特定功效基因部分片段被同源外源DNA片段替換，從而使靶基因失活?；蚯萌耄╣eneknockin）：外源功效基因與宿主基因組中同源序列進行同源重組，插入到基因組中，從而在細胞內取得表示。基因打靶（genetargeting）29/39基因敲除小鼠產生1.體外構建基因敲除載體：靶基因同源DNA序列+選擇性標識基因2.將基因敲除載體導入ES細胞：顯微注射法、電穿孔法等3.篩選、判定發(fā)生了同源重組ES細胞：標識篩選法、分子判定法4.將ES細胞導入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠子宮5.小鼠交配傳代取得特定純合基因型子代小鼠30/39Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出現(xiàn)顯著體重增加現(xiàn)象31/39REGγ基因敲除鼠（下列圖）出現(xiàn)脊椎彎曲等早衰現(xiàn)象32/39Gab1基因敲除造成小鼠缺血性血管新生、側枝循環(huán)建立出現(xiàn)缺點（圖示上半部分），主要是因為血管內皮細胞管狀結構形成信號調控通路出現(xiàn)障礙而引發(fā)（圖示下半部分）。33/39酪氨酸酶基因敲除后，原來是黑色小豬，變成了白色，表現(xiàn)出經(jīng)典白化病特征。34/39基因編輯（geneediting）對目標基因進行“編輯”，實現(xiàn)對特定DNA片段敲除、加入等。

CRISPR/Cas系統(tǒng)：由CRISPR基因座與其串聯(lián)Cas基因組成，經(jīng)過序列特異RNA介導，切割降解DNA。35/39Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CR