脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程DB41-T 987-2014

ICS65.020

B16

DB41

河南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB41/T987—2014

脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程

Technicalcriterionforvirusdetectionofvirus-freesweetpotatoseedtuberor

seedling

2014-12-30發(fā)布2015-03-01實(shí)施

河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB41/T987－2014

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2術(shù)語和定義........................................................................1

2.1脫毒組培苗....................................................................1

2.2擴(kuò)繁苗........................................................................1

2.3脫毒種薯（苗）................................................................1

2.4原原種........................................................................1

2.5原種..........................................................................1

2.6大田用種......................................................................1

2.7允許帶毒率....................................................................2

2.8允許病毒顯癥率................................................................2

3檢測對(duì)象..........................................................................2

4抽樣..............................................................................2

4.1組培苗抽樣....................................................................2

4.2田間抽樣......................................................................2

5檢測方法..........................................................................2

5.1硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法...............................2

5.2指示植物檢測法................................................................3

5.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測法...................................................3

5.4反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法..........................................3

6脫毒種薯（苗）的檢測程序及質(zhì)量要求................................................3

6.1脫毒組培苗....................................................................3

6.2原原種........................................................................3

6.3原種..........................................................................3

6.4大田用種......................................................................3

附錄A（規(guī)范性附錄）硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法.................4

附錄B（規(guī)范性附錄）指示植物檢測法..................................................6

附錄C（規(guī)范性附錄）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測法.....................................7

附錄D（規(guī)范性附錄）反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法............................9

I

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前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張振臣、喬奇、秦艷紅、張德勝、王爽、田雨婷、王永江。

II

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脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測的術(shù)語定義、檢測對(duì)象、抽樣、檢測方法和脫毒種薯（苗）

的檢測程序及質(zhì)量要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于脫毒甘薯種薯（苗）的病毒檢測。

2術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

2.1

脫毒組培苗virus-freetissuecultureseedling

利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)獲得的再生組培苗，經(jīng)檢測，確認(rèn)不含甘薯羽狀斑駁病毒（Sweetpotato

featherymottlevirus，SPFMV）、甘薯潛隱病毒（Sweetpotatolatentvirus，SPLV）、甘薯G病毒

（SweetpotatovirusG，SPVG）、甘薯病毒2（Sweetpotatovirus2，SPV2）、甘薯褪綠斑病毒（Sweet

potatochloroticfleckvirus，SPCFV）、甘薯褪綠矮化病毒（Sweetpotatochloroticstuntvirus，

SPCSV）和甘薯卷葉病毒（Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCV）的種苗。

2.2

擴(kuò)繁苗propagationseedling

由脫毒組培苗在無菌條件下或者防蟲溫（網(wǎng)）室內(nèi)快繁后得到的甘薯苗。

2.3

脫毒種薯（苗）virus-freeseedtuberorseedling

由脫毒組培苗經(jīng)逐代繁殖增加種薯（苗）數(shù)量的種薯（苗）生產(chǎn)體系生產(chǎn)出來的種薯（苗）。分原

原種、原種、大田用種三個(gè)級(jí)別。

2.4

原原種pre-elite

用脫毒組培苗或擴(kuò)繁苗在防蟲網(wǎng)室內(nèi)生產(chǎn)出的符合質(zhì)量要求的種薯（苗）。

2.5

原種elite

用原原種作種薯，在隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量要求的種薯（苗）。

2.6

大田用種certifiedseed

用原種作種薯，在隔離條件下生產(chǎn)出的符合質(zhì)量要求的種薯（苗）。

2.7

允許帶毒率permissionvirus-carryingrate

各級(jí)甘薯種薯（苗）繁殖田中允許攜帶病毒植株的比率。

2.8

允許病毒顯癥率permissionvirus-symptomrate

1

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各級(jí)甘薯種薯（苗）繁殖田中允許出現(xiàn)病毒病癥狀植株的比率。

3檢測對(duì)象

甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）；

甘薯潛隱病毒（SPLV）；

甘薯G病毒（SPVG）；

甘薯病毒2（SPV2）；

甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）；

甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）；

甘薯卷葉病毒（SPLCV）。

4抽樣

4.1組培苗抽樣

4.1.1脫毒組培苗

每株均應(yīng)檢測。

4.1.2擴(kuò)繁苗

隨機(jī)抽取1%～2%的擴(kuò)繁苗檢測。

4.2田間抽樣

4.2.1原原種田抽樣

定植后30d、60d、收獲前2周，在目測的基礎(chǔ)上，采用五點(diǎn)取樣法。面積≤0.1hm2，抽取數(shù)量為

200株；0.1hm2＜面積≤1hm2，抽取數(shù)量為500株；每超出1hm2面積，劃出另一檢驗(yàn)區(qū)，按本規(guī)程規(guī)定

的面積取樣。每株取上、中、下部葉片1g～5g，-20℃以下低溫保存。

4.2.2原種田和大田用種田抽樣

定植后30d、收獲前兩周，在目測的基礎(chǔ)上，采用五點(diǎn)取樣法。取樣方法及樣品保存同4.2.1。

5檢測方法

5.1硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法

用于檢測SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種病毒，檢測法見附錄A。

5.2指示植物檢測法

用于輔助檢測SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV和SPLCV共7種病毒，檢測法見附錄B。

5.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測法

用于檢測SPLCV。檢測法見附錄C。

2

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5.4反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法

用于檢測SPCSV。檢測法見附錄D。

6脫毒種薯（苗）的檢測程序及質(zhì)量要求

6.1脫毒組培苗

樣品同時(shí)利用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR和指示植物4種方法進(jìn)行檢測，4種方法的檢測結(jié)果均應(yīng)為陰

性，即允許帶毒率為0。

6.2原原種

先目測調(diào)查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物法進(jìn)行檢測，至少其中10%的樣品分

別利用PCR和RT-PCR檢測。允許帶毒率為0，允許病毒顯癥率為0。

6.3原種

先目測調(diào)查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物進(jìn)行檢測，至少其中5%的樣品分別

利用PCR和RT-PCR檢測。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允許帶毒率≤2.0%，SPCSV和SPLCV的允許

帶毒率為0。允許病毒顯癥率≤1.0%。

6.4大田用種

先目測調(diào)查樣品的病毒顯癥率，然后利用NCM-ELISA或指示植物進(jìn)行檢測，至少其中1%的樣品分別

利用PCR和RT-PCR檢測。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2和SPCFV的允許帶毒率≤10.0%，SPCSV和SPLCV的允許

帶毒率為0，允許病毒顯癥率≤5.0%。

3

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法

A.1溶液配制

除非另有規(guī)定僅使用分析試劑。水為無菌蒸餾水。

A.1.1Tris-HCl溶液[c(Tris-HCl)=1.0mol/L]：稱取60.60g的三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶于

300mL無菌蒸餾水中，加入32.5mL濃鹽酸（HCl），調(diào)節(jié)pH值為7.5，定容至500mL。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.2氯化鈉溶液[c(NaCl)=5.0mol/L]：稱取292.20g氯化鈉，在800mL無菌蒸餾水中，溶解定容至

1L。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.3三羥甲基氨基甲烷溶液（TBS）：分別取1mol/LTris-HCl（A.1.1）20mL和5mol/L氯化鈉

（A.1.2）100mL，混合后用無菌蒸餾水定容至1L。

A.1.4洗滌緩沖液（TBST）：0.5mL吐溫-20（Tween-20）溶于1LTBS（A.1.3）中。

A.1.5抽提緩沖液：稱取亞硫酸鈉（Na2SO3）0.20g溶于TBS（A.1.3）中，定容至100mL。

A.1.6封閉緩沖液：稱取脫脂奶粉0.50g，分別量取曲拉通（Triton）X-1000.5mL和TBS（A.1.3）

25mL。先將脫脂奶粉溶于少量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至25mL，加入TritonX-100

混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.1.7抗體緩沖液：稱取脫脂奶粉1.00g，量取TBS（A.1.3）50mL。先將脫脂奶粉溶解于少量TBS

（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至50mL。

A.1.8底物緩沖液：分別稱取三羥甲基氨基甲烷6.10g、氯化鈉2.90g、氯化鎂（MgCl2?6H2O）

0.50g，溶于400mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)pH值至9.5，定容至500mL。

A.1.9氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）儲(chǔ)備液：稱取0.04gNBT溶于1.2mL70%N，N-二甲基甲酰胺（DMF）

中，-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.105-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（BCIP）儲(chǔ)備液：稱取0.02gBCIP溶于1.2mLN，N-二甲基甲酰

胺（DMF）中，-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

A.1.11NBT/BCIP底物溶液：先后取100μLNBT貯備液（A.1.9）和100μLBCIP貯備液（A.1.10），加

入25mL底物緩沖液中，振搖混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.2樣品制備

將待測葉片用清水清洗干凈，從每一樣品上中下部的葉片上各取一直徑約1cm圓片。放入研缽中，

加入3mL抽提緩沖液充分研磨，6000r/min離心2min，取上清液點(diǎn)膜。

A.3操作步驟

A.3.1點(diǎn)膜

將劃好方格（1cm×1cm）的硝化纖維素膜用TBS緩沖液處理后放在潔凈的濾紙上，每個(gè)樣品各吸

取15μL上清液滴在膜上方格的正中，室溫干燥15min～30min。同時(shí)設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照。根據(jù)

需要設(shè)置重復(fù)。

4

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A.3.2封閉

將干燥后的膜浸入封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩1h，轉(zhuǎn)速為50r/min。

A.3.3與一抗反應(yīng)

將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的病毒特異性抗體溶液中，室溫下?lián)u床振蕩10h～12h，轉(zhuǎn)

速為50r/min。

A.3.4洗膜

用洗滌緩沖液洗膜4次，每次搖床振蕩3min，轉(zhuǎn)速為80r/min。

A.3.5與二抗反應(yīng)

用濾紙將膜表面的溶液吸干，將膜放入用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體溶液

中，室溫下?lián)u床振蕩1h，轉(zhuǎn)速為50r/min。

A.3.6洗膜

洗滌4次，方法同A.3.4。

A.3.7顯色

用濾紙將膜表面的溶液吸干，將膜置于NBT/BCIP底物溶液中，避光緩慢搖動(dòng)。

A.3.8終止反應(yīng)

棄去底物溶液并用蒸餾水洗膜3次，每次搖床振蕩10min，轉(zhuǎn)速為50r/min。

A.3.9結(jié)果判斷

晾干后觀察顏色反應(yīng)，陽性樣品在膜上形成紫色沉淀，陰性樣品則無顏色反應(yīng)。

5

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BB

附錄B

（規(guī)范性附錄）

指示植物檢測法

B.1繁育指示植物

在防蟲條件下盆栽巴西牽牛（Ipomoeasetosa），至1～2片真葉時(shí)嫁接。

B.2嫁接

以待測樣品的莖蔓為接穗，巴西牽牛為砧木，在巴西牽牛的莖部（子葉處）斜切，將待檢樣品底端

削成楔型，插入砧木的切口內(nèi)，用封口膜扎緊，置25℃～30℃防蟲網(wǎng)室內(nèi)，嫁接15d～30d后觀察記

載癥狀。每個(gè)樣品重復(fù)至少3次（3株），同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照。

B.3結(jié)果判斷

根據(jù)巴西牽牛是否表現(xiàn)花葉、葉片扭曲、明脈、黃化以及植株矮化等癥狀，確定是否帶毒。所有嫁

接的巴西牽牛植株均沒有表現(xiàn)任何病毒病癥狀，樣品為陰性；只要有1株表現(xiàn)病毒病癥狀，該樣品判斷

為陽性。

6

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CC

附錄C

（規(guī)范性附錄）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測法

該方法用于檢測甘薯卷葉病毒（SPLCV）。

C.1試劑及緩沖液配制

先用按C.1.1～C.1.6配方配置50倍的濃貯存液，使用時(shí)再用無菌蒸餾水稀釋至工作濃度。

C.1.1TAE電泳緩沖液：稱取三羥基甲基氨基甲烷（Tris）242.0g、冰乙酸57.1mL、Na2EDTA?2H2O

37.2g，用氫氧化鈉調(diào)pH值至8.5，滅菌雙蒸水定容至1L。

C.1.2溴化乙錠（EB）溶液：稱取溴化乙錠20.00mg溶于20mL滅菌雙蒸水中。

C.1.31.0%瓊脂糖凝膠板：稱取1.00g瓊脂糖加入100mLTAE電泳緩沖液中，在微波爐中加熱至瓊脂

糖融化，溫度降至50℃～60℃時(shí)，加溴化乙錠溶液（EB）5μL，搖勻，倒入電泳槽中均勻鋪板，凝固

后取下梳子使用。

C.1.4CTAB緩沖液：稱取CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）20.00g、NaCl81.80g、EDTA5.80g和

Tris12.10g，溶于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)pH值至8.0，高溫滅菌后加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）

10.00g。

C.1.5TE緩沖液：稱取EDTA0.30g和Tris1.20g，溶于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)pH值至8.0，高溫滅菌。

C.1.6加樣緩沖液：稱取EDTA0.88g、溴酚藍(lán)0.05g，量取丙三醇36mL，溶于100mL蒸餾水中，

用氫氧化鈉調(diào)pH值至7.0。

C.2DNA提取-CTAB法

預(yù)熱（60℃）CTAB緩沖液(C.1.4)。取0.5g新鮮植物材料，于液氮中研磨成粉，把粉末倒入盛有

預(yù)熱的600μLCTAB緩沖液(C.1.4)的1.5ml的eppendorf管中，再加入20μL巰基乙醇，輕輕混勻；

60℃保溫1h，其間搖動(dòng)幾次；加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），輕輕混勻，室溫下4500r/min

離心10min；將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3體積的異丙醇，小心混勻后-20℃放置30min以上，

可見DNA絮狀沉淀；10000r/min離心10min，棄去上清液；沉淀加清洗緩沖液（70%乙醇，100mmol/L

醋酸銨）漂洗2～3次，10000r/min離心10min，沉淀風(fēng)干后溶于50μLTE緩沖液(C.1.5)。開展后續(xù)

試驗(yàn)或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

C.3PCR

C.3.1引物

上游引物BM-V：5ˊ-KSGGGTCGACGTCATCAATGACGTTRTAC-3ˊ，

下游引物BM-C：5ˊ-AARGAATTCATKGGGGCCCARARRGACTGGC-3ˊ。

C.3.2PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：滅菌重蒸水36.7μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×ExTaqBuffer(含MgCl2)

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5μL，上游引物BM-V（10μmol/L）和下游引物BM-C（10μmol/L）各1μL，ExTaqDNA聚合酶(5U/μL)

0.3μL，模板DNA2μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，條件為94℃1min、

55℃1min和72℃3min，最后72℃延伸10min。

C.3.3PCR產(chǎn)物的電泳檢測

制備1.0%瓊脂糖凝膠板（C.1.3）。在電泳槽中加入TAE電泳緩沖液(C.1.1)。每個(gè)樣品取10μLPCR

產(chǎn)物與加樣緩沖液混合后，加入凝膠孔進(jìn)行電泳。恒壓（120V～150V）下電泳20min～30min，經(jīng)EB

染色后，將凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

C.3.4試驗(yàn)成立的條件

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，陽性對(duì)照在預(yù)期大?。?800bp）的位置出現(xiàn)特異性條帶，同時(shí)，陰性對(duì)照和

空白對(duì)照均沒有出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶。

C.3.5結(jié)果判定

應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測，如果在2800bp對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣

品為SPLCV病毒陽性，否則判定樣品為該病毒陰性。

8

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DD

附錄D

（規(guī)范性附錄）

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法

該方法用于檢測甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）。

D.1試劑及緩沖液配制

D.1.1DEPC水：取焦碳酸二乙酯（DEPC)50μL加至100mL滅菌蒸溜水中，室溫放置10h～12h，

121℃高溫滅菌15min，分裝到DEPC（D.1.1）處理過的離心管中。

D.1.2引物溶液：用DEPC水（D.1.1）將上、下游引物分別配制成濃度為10μmol/L的溶液。

D.1.3TAE電泳緩沖液、1.0%瓊脂糖凝膠板和溴化乙錠（EB）溶液：TAE電泳緩沖液、溴化乙錠（EB）

溶液和1.0%瓊脂糖凝膠板配制方法分別同附錄C.1.1、C.1.2和C.1.3。

D.2RNA提取-Trizol法

稱取0.1g葉片放于研缽中，加液氮充分研磨成粉，將粉末迅速轉(zhuǎn)入到無RNase的無菌1.5mL離心

管中，加入1mLTrizol迅速振蕩混勻；4℃12000r/min，離心5min；取上清液，加入200μL氯仿，

混勻，室溫放置15min；4℃，12000r/min，離心15min；吸取上層水相至新的無菌1.5mL離心管中，

加入0.5mL異丙醇，混勻，室溫放置10min；4℃，12000r/min，離心10min，棄上清液，留沉淀；

加入1mL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4℃，12000r/min，離心5min，棄上清液，將離心

管倒置于滅菌濾紙上，自然干燥；加入25-200μLDEPC水（D.1.1）溶解沉淀，即得到總RNA。

D.3RT-PCR

D.3.1引物

上游引物CSV70P1：5ˊ-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3ˊ，

下游引物CSV70P2：5ˊ-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3ˊ。

D.3.2反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：dNTPs（10mmol/L）1μL，MgCl2（25mmol/L）1μL，5×AMV緩沖液2μL，

AMV（5U/μL）0.5μL，RNase抑制劑（40U/μL）0.25μL，模板核酸5μL，下游引物CSV70P2（10μmol/L）

0.5μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42℃50min，99℃5min。

D.3.3PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：滅菌重蒸水33.7μL，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，10×ExTaqBuffer(含MgCl2)

5μL，上游引物CSV70P1（10μmol/L）和下游引物CSV70P2（10μmol/L）各1μL，ExTaqDNA聚合酶

(5U/μL)0.3μL，cDNA5μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，條件為94℃30s、

55℃30s和72℃50s，最后72℃延伸10min。

D.3.4PCR產(chǎn)物的電泳檢測

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制備1.0%瓊脂糖凝膠板（C.1.2）。在電泳槽中加入1×TAE緩沖液。每個(gè)樣品取10μLPCR產(chǎn)物與

加樣緩沖液混合后，加入凝膠孔進(jìn)行電泳。恒壓（120V～150V）下電泳20min～30min，經(jīng)EB染色后，

將凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

D.3.5試驗(yàn)成立的條件

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，陽性對(duì)照在預(yù)期大小（431bp）的位置出現(xiàn)特異性條帶，同時(shí)，陰性對(duì)照和

空白對(duì)照均沒有出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶。

D.3.6結(jié)果判定

應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測，如果在431bp對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣品

為SPCSV病毒陽性，否則判定樣品為該病毒陰性。

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DB41/T987－2014

目次

前言................................................................................II

1范圍..............................................................................1

2術(shù)語和定義........................................................................1

2.1脫毒組培苗....................................................................1

2.2擴(kuò)繁苗........................................................................1

2.3脫毒種薯（苗）................................................................1

2.4原原種........................................................................1

2.5原種..........................................................................1

2.6大田用種......................................................................1

2.7允許帶毒率....................................................................2

2.8允許病毒顯癥率................................................................2

3檢測對(duì)象..........................................................................2

4抽樣..............................................................................2

4.1組培苗抽樣....................................................................2

4.2田間抽樣......................................................................2

5檢測方法..........................................................................2

5.1硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法...............................2

5.2指示植物檢測法................................................................3

5.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測法...................................................3

5.4反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法..........................................3

6脫毒種薯（苗）的檢測程序及質(zhì)量要求................................................3

6.1脫毒組培苗....................................................................3

6.2原原種........................................................................3

6.3原種..........................................................................3

6.4大田用種......................................................................3

附錄A（規(guī)范性附錄）硝酸纖維素膜酶聯(lián)免疫吸附測定（NCM-ELISA）檢測法.................4

附錄B（規(guī)范性附錄）指示植物檢測法..................................................6

附錄C（規(guī)范性附錄）