藥物的含量測定方法與驗證

關于藥物的含量測定方法與驗證基本要求

一、掌握定量分析方法驗證的效能指標。二、熟悉定量分析樣品的前處理方法。三、了解定量分析樣品的前處理方法的進展及在藥物分析中的應用。第2頁,共57頁，星期六，2024年，5月含量測定：

藥物的含量測定系指運用化學、物理化學或生物學的方法測定藥物中主要有效成分的含量。第3頁,共57頁，星期六，2024年，5月第一節(jié)容量分析法（一）容量分析法的特點：常用于測定高含量或中含量組分，原料藥含量測定首選比較準確（相對誤差＜0.2%）；操作簡單、快速；儀器普通易得；第4頁,共57頁，星期六，2024年，5月（二）有關計算

1.滴定度（T）：每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當于被測物質的質量(mg)2.滴定度的計算

aA（待測物）

+bB（滴定液）

cC+dD

ab

T/M

1·m

T=m×a/b×Mm：滴定液濃度(mol/L)M：被測物分子量第5頁,共57頁，星期六，2024年，5月3.百分含量的計算（1）直接滴定法設至終點時，消耗滴定液體積為Vml則藥物實測質量為V·T濃度校正因子W：供試品取樣量

第6頁,共57頁，星期六，2024年，5月（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法）

藥物+A（定、過量）→················剩余的A+B→·······（回滴）······V

空白試驗···········································V0第7頁,共57頁，星期六，2024年，5月光譜

光譜分析法

分光光度法

分類

紫外-可見分光光度法

紅外分光光度法

原子吸收分光光度法

熒光分光光度法

火焰光度法第二節(jié)分光光度法第8頁,共57頁，星期六，2024年，5月

二、光譜分析法

（一）紫外-可見分光光度法

吸收光譜范圍：紫外：200～400nm

可見：400～760nm靈敏度高，可達10-4g/ml-10-7g/ml1.特點準確度高，RSD（%）為2%-5%儀器價格低廉，操作簡單，易普及，應用廣范2.朗伯-比耳定律A=ECL

吸收系數(shù)：摩爾吸收系數(shù)ε——研究分子結構百分吸收系數(shù)Ｅ——含量測定第9頁,共57頁，星期六，2024年，5月3.儀器的校正和檢定

波長的校正：汞燈中的幾根較強的譜線或用儀器自身所帶的氘燈的特定譜線為參照進行校正吸收度準確性的檢定：重鉻酸鉀的硫酸溶液，規(guī)定波長處測定Ｅ，應符合規(guī)定雜散光的檢查：一定濃度的碘化鈉和亞硝酸鈉溶液，規(guī)定波長處測定透光率，應符合規(guī)定第10頁,共57頁，星期六，2024年，5月

4.對溶劑的要求:含雜原子的有機溶劑通常具有很強的末端吸收它們的使用范圍均不能小于截止使用波長石英吸收池、空氣為空白

λ(nm)溶劑+吸收池A220～240≤0.40241～250≤0.20251～300≤0.10300以上≤0.05第11頁,共57頁，星期六，2024年，5月5.測定方法

要求供試品溶液的A應在0.3～0.7

1）對照品比較法：A供／A對＝C供／C對原料藥：制劑：第12頁,共57頁，星期六，2024年，5月2）吸收系數(shù)法：注意：應>100應注意儀器的校正和檢定：作為計算濃度的因數(shù)進行定量的方法，不是任何情況下都適用的，特別時單色光不純的情況下，A會隨儀器不同而變化，誤差較大但若認定一臺儀器，固定其工作狀態(tài)和測定條件，則C和A間的關系在多數(shù)情況下仍符合Lambert－Beer定律

第13頁,共57頁，星期六，2024年，5月3）計算分光光度法：方法有多種，具體按每種藥物規(guī)定的方法進行。如：VA的三點校正法4）比色法

加入顯色劑后，按照對照品比較法測定影響顯色因素很多，故需注意平行操作空白溶劑：溶劑+顯色劑，同法處理第14頁,共57頁，星期六，2024年，5月

（二）熒光分析法

靈敏度高，可達10-10g/ml～

10-12g/ml

在低濃度進行測定，防止自熄滅作用1.特點用基準溶液代替對照液校正儀器靈敏度制備熒光衍生物，可提高靈敏度和選擇性

干擾因素多，需做空白實驗樣品用量少，操作簡單，應用范圍較廣

第15頁,共57頁，星期六，2024年，5月2.含量測定

原理：當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強度R與該物質濃度C成正比

方法：對照品比較法計算：第16頁,共57頁，星期六，2024年，5月

第三節(jié)色譜法

根據(jù)混合物中各組分的色譜行為差異，先行分離后再在線或離線對各組分逐一進行分析的方法，是分離分析混合物的最有力手段。

按分離原理：吸附；分配；離子交換；空間排阻分類

按分離方法：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC

特點：高靈敏度、高效能、高速度、應用廣泛第17頁,共57頁，星期六，2024年，5月（一）HPLC法

1.對儀器一般要求

固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變其他均可適當改變色譜圖20分鐘內(nèi)記錄完畢

2.系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱的理論板數(shù)：n=5.54(tR/Wh/2)2分離度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);應大于1.5重復性：對照液連續(xù)進樣5次，峰面積RSD≤2.0％拖尾因子：T=W0.05h/2d1

應在0.95～1.05

第18頁,共57頁，星期六，2024年，5月流動相真空脫氣機四元泵自動進樣器柱溫箱紫外檢測器蒸發(fā)光散射檢測器第19頁,共57頁，星期六，2024年，5月液質聯(lián)用儀質譜檢測器第20頁,共57頁，星期六，2024年，5月流動相：對于以C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，常用甲醇-水，間或加以乙腈、緩沖液等為流動相，有機溶劑比例通常不低于5％第21頁,共57頁，星期六，2024年，5月四元泵第22頁,共57頁，星期六，2024年，5月自動進樣器第23頁,共57頁，星期六，2024年，5月色譜柱填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠第24頁,共57頁，星期六，2024年，5月檢測器第25頁,共57頁，星期六，2024年，5月測定方法1)內(nèi)標法加校正因子測定供試品中主成分含量峰面積含量對照液（R）：ARCR

內(nèi)標液（S）：ASCS供試液（X）：AXCXf=————AS/CSAR/CRf=————A’S/C’SAx/CxCx=f·————

AxA’S/C’S第26頁,共57頁，星期六，2024年，5月2)外標法測定供試品中主成分含量對照液（R）：ARCR

供試液（X）：AXCX要求：進樣量準確、操作條件穩(wěn)定CXCRAXAR——＝——CX＝————CR·AXAR第27頁,共57頁，星期六，2024年，5月

（二）GC法1.對GC儀器一般要求

載氣：氮氣色譜柱：填充柱或毛細管柱填充柱：內(nèi)徑2～4mm，長1～10m，內(nèi)裝吸附劑高分子多孔小球或涂漬固定液的載體毛細管柱：內(nèi)徑0.2～0.5mm，長10～100m，一般為空心柱，內(nèi)壁或載體經(jīng)涂漬或交聯(lián)固定液檢測器：氫火焰離子化檢測器色譜圖：30分鐘內(nèi)記錄完畢

2.色譜適用性實驗：同HPLC

3.測定法：同HPLC第28頁,共57頁，星期六，2024年，5月

第四節(jié)藥品分析方法驗證

目的：證明采用的方法適合于相應檢測要求。

起草藥品質量標準生產(chǎn)工藝變更制劑組分改變原分析方法修訂驗證內(nèi)容：準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性均需對分析方法進行驗證第29頁,共57頁，星期六，2024年，5月一、準確度（accuracy）：測量值與真實值接近的程度表示:回收率測定方法：回收試驗

加樣回收試驗第30頁,共57頁，星期六，2024年，5月含量測定方法的準確度

1.原料藥：可用已知純度對照品或供試品進行測定；或與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較

2.制劑：考察其他組分和輔料對回收率的影響

①用含已知量被測物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進行測定，回收率計算同原料藥②向制劑中加入已知量的被測物進行測定

③與已知準確度的另一方法測定的結果進行比較具體做法：

測定高、中、低三個濃度，n=3,共9個數(shù)據(jù)來評價回收率；用UV和HPLC法時，一般回收率可達98%～102%；容量法可達99.7%～100.3%第31頁,共57頁，星期六，2024年，5月二、精密度（precision）：定義:

同一樣品多次測量值之間相互接近的程度表示：偏差，標準偏差,相對標準偏差

1.偏差(deviation,d)

d=測得值-平均值=Xi-X2.標準偏差（standarddeviation,SD或S）

S=[(∑Xi–X)2/(n-1)]1/23.

相對標準偏差(relativestandarddeviation,RSD)

RSD=標準偏差/平均值×100%=S/X×100%

第32頁,共57頁，星期六，2024年，5月重復性:

同一實驗室,同一人多次測定的精密度中間精密度:

同一實驗室，不同人，不同儀器測定的精密度重現(xiàn)性:不同實驗室，不同人測定的精密度數(shù)據(jù)要求均應報告標準偏差、相對標準偏差和可信限第33頁,共57頁，星期六，2024年，5月三、專屬性（specificity）:指在其他成分(如雜質、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準確測定出被測物的特性（鑒別、雜質檢查、含量測定方法，均應考察其專屬性）

1.鑒別反應應能與其它共存的物質或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應呈現(xiàn)負反應第34頁,共57頁，星期六，2024年，5月

2.含量測定和雜質測定

色譜法和其他分離法，應附代表性的圖譜，以說明專屬性。

圖中注明各組分位置，色譜法中分離度應符合要求。在能獲得雜質的情況下，可加到試樣中，考察對結果的干擾。在雜質和降解物不能獲得的情況下，可用以驗證方法和藥典方法進行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。第35頁,共57頁，星期六，2024年，5月

四、檢測限（limitofdetection，

LOD)

是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗指標。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。1.目視法用含已知濃度被測物的試樣進行分析，目視確定能被可靠地檢測出的被測物的最低濃度或量，常用于顯色鑒別法，TLC2.當用GC和HPLC法時，一般以S/N＝2或3時的相應濃度來確定檢測限。第36頁,共57頁，星期六，2024年，5月

五、定量限（1imitofquantitation，

LOQ)

是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具一定準確度和精密度。雜質和降解產(chǎn)物進行定量測定時，要求LOQ。常用信噪比法確定定量限。一般以S/N=10時相應的濃度進行測定。第37頁,共57頁，星期六，2024年，5月

六、線性（linearity）

是指在設計的范圍內(nèi)，測試結果與試樣中被測物濃度或量直接呈正比關系的程度?；貧w方程的相關系數(shù)（r）越接近1，表明線性越好可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列（至少5份）供試液進行測定，以響應值對濃度作圖，建立回歸方程，求出r如UV：制備一個標準系列，濃度點n=5A=0.3-0.7建立回歸方程C=aA+br＞0.9999第38頁,共57頁，星期六，2024年，5月CA500.22750.351000.451250.581500.69AC線性的偏離………﹍﹍﹍第39頁,共57頁，星期六，2024年，5月七、范圍

（range）

是指達到一定精密度、準確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。

如原料藥和制劑含量測定：應為測試濃度的80%～120%制劑含量均勻度檢查：應為測試濃度的70%-～130%。溶出度或釋放度中的溶出量測定：應為限度的±20%。第40頁,共57頁，星期六，2024年，5月

八、耐用性（robustness）

是指在測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。典型的變動因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時間等。HPLC變動因素有：流動相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。GC變動因素有：色譜柱，固定相，擔體、柱溫、進樣口和檢測器溫度等。第41頁,共57頁，星期六，2024年，5月檢驗項目和驗證內(nèi)容：項目內(nèi)容鑒別雜質測定含量測定及溶出量測定定量限度準確度＋＋精密度－＋重復性＋＋中間精密度＋①＋①專屬性②＋＋＋＋檢測限－③＋－定量限＋－線性＋＋范圍＋＋耐用性＋＋＋①已有重現(xiàn)性驗證，不需驗證中間精密度②如一種方法不夠專屬，可用其他分析方法予以補充③視具體情況予以驗證第42頁,共57頁，星期六，2024年，5月

第五節(jié)定量分析樣品的前處理方法一、概述

1.結構特征與分析方法之間的關系①含鹵素有機藥物R-X（F，Cl,Br,I）鹵素與芳環(huán)相連Ar-X結合牢固

鹵素與脂肪鏈相連R-X結合較不牢固②含金屬有機藥物

含金屬有機藥物R-O-Me，有機酸或酚的金屬鹽/配位化合物；結合不牢固，可直接測定

有機金屬藥物R-Me

，結合牢固，適當處理后測定

第43頁,共57頁，星期六，2024年，5月

不經(jīng)有機破壞的分析方法2.藥物分析中常用的分析方法經(jīng)有機破壞的分析方法第44頁,共57頁，星期六，2024年，5月二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（一）直接測定法

例如：富馬酸亞鐵的含量測定

終點：

鄰二氮菲(+Fe3+)溶于熱稀礦酸指示劑:鄰二氮菲(+Fe2+)紅色淡藍色Fe3+Fe2+Ce4+第45頁,共57頁，星期六，2024年，5月（二）經(jīng)水解后測定法

1.堿水解后測定法

適用于X與脂肪鏈相連的鹵代烷烴例如：三氯叔丁醇的含量測定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl↓+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN↓+NH4NO3

2.酸水解后測定法

例如：硬脂酸鎂的含量測定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

△三氯叔丁醇第46頁,共57頁，星期六，2024年，5月（三）經(jīng)還原分解后測定法

適用于Ar-I的藥物

例如：泛影酸的含量測定指示劑：曙紅鈉終點：黃→紅第47頁,共57頁，星期六，2024年，5月

三、經(jīng)有機破壞的分析方法

金屬原子、鹵素等與C結合牢固者，必須有機破壞

常用的有機破壞的方法有濕法破壞干法破壞第48頁,共57頁，星期六，2024年，5月（一）干法破壞

適用于含鹵素、S、P等有機藥物分析的前處理，也用于某些藥物中硒及砷鹽的檢查。

1.高溫熾灼法加無水Na2CO3、硝酸鎂、氫氧化鈣或ZnO以助灰化2.氧瓶燃燒法第49頁,共57頁，星期六，2024年，5月

1）儀器裝置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬質玻璃錐形瓶2）稱樣固體樣；液體樣要求

3）燃燒分