選修三專題1基因工程-唐海

普通高中課程標(biāo)準(zhǔn)實驗教科書選修3現(xiàn)代生物科技專題人民教育出版社生物室2010年5月現(xiàn)代生物科技專題科學(xué)技術(shù)現(xiàn)代基因工程克隆技術(shù)胚胎工程生態(tài)工程基本概念和基本原理技術(shù)流程、操作和應(yīng)用倫理問題生物技術(shù)的安全性與倫理問題社會交流、討論、辯論基因工程專題1基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達爾文提出生物進化論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德爾提出基因的分離定律和自由組合定律基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實驗加以證明。基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)2)工具酶的發(fā)現(xiàn)3)DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明4)DNA體外重組的實現(xiàn)5)重組DNA表達實驗的成功6)第一例轉(zhuǎn)基因動物問世7)PCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)發(fā)明每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實現(xiàn)了細菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——

據(jù)WTO調(diào)查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國約6000萬。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達。這些性狀的表達與我們學(xué)過的基因的什么過程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用基因工程的產(chǎn)物什么叫基因工程？

基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向地改造生物的遺傳特性?；蚬こ痰母拍罨蚬こ痰母拍罨蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性一、DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞一、DNA重組技術(shù)的基本工具解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運輸車”——基因進入受體細胞的載體1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具思考：⒈自然界是否存在一種生物的DNA進入另一生物的情況？2.單細胞生物并沒有在進化中滅絕，有何保護機制？

可能產(chǎn)生了一些特殊的酶來防范?？啥@種酶能識別外來侵入的DNA并將其分解，而對自身的DNA不能起作用?！胺肿邮中g(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？防止外來病原物的侵害。當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。思考與探究P7（2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？1、細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列；2、通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。一、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點（特異性）4.限制酶識別序列5.作用結(jié)果：識別特定核苷酸序列，并且使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要從原核生物中分離純化產(chǎn)生黏性末端或平末端Goon大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成⒉種類與命名：

現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia

marcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）GobackGoback限制酶DNA解旋酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈限制酶的識別序列：Goback能被限制性內(nèi)切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。

EcoRⅠ黏性末端黏性末端

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重復(fù)演示什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端

限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列的。想一想限制酶所識別的序列有什么特點？限制酶的識別序列：能被限制性內(nèi)切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩個切口，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？

會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……酶切二、“分子縫合針”

——DNA連接酶①作用:

把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.②作用原理：催化磷酸二酯鍵形成

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別（二）“分子縫合針”——DNA連接酶DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點尋根問底DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板三、“分子運輸車”

——基因進入受體細胞的載體⒈載體需要的條件：⑴有1~多個限制酶切點⑵對受體細胞無害⑶導(dǎo)入基因能在受體細胞中復(fù)制、表達⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⒉常用運載體：⑴細菌的質(zhì)粒⑵噬菌體或某些動植物病毒⑶假如目的基因?qū)胧荏w細胞后不能復(fù)制或不能轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？⑴作為分子運輸車——載體，如果沒有切割位點將會怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個限制酶切點，你會用它來做分子運輸車嗎？

⑷目的基因有沒有進入受體細胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別2、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨立于細菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P71）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細胞有害，或不能進入到除受體細胞外的其他生物細胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。3、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P7思考與探究P71、為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？

通過長期的進化，細菌中含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵?；虿僮鞯墓ぞ咭?“分子手術(shù)刀":限制性核酸內(nèi)切酶來源:主要來自原核生物作用:將外來的DNA切斷結(jié)果:產(chǎn)生黏性末端或平末端二.“分子縫合針”:DNA連接酶分類:E·coliDNA連接和T4DNA連接酶作用:把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來三.“分子運輸車”:基因進入受體細胞的載體種類:質(zhì)粒、動植物病毒等條件:自我復(fù)制、限制酶切點、標(biāo)記基因、安全的、大小應(yīng)適合1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體

C、載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C鞏固練習(xí)2）下列不是基因載體具備的條件的是

A、能自我復(fù)制（）

B、有多個限制酶切點

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD鞏固練習(xí)3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性核酸內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由載體導(dǎo)入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A鞏固練習(xí)4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）

A、限制酶只在獲得目的基因時才用

B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成

C、質(zhì)粒都可作為載體

D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D鞏固練習(xí)5）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細胞

D、目的基因的檢測和表達C鞏固練習(xí)§1.2基因工程的基本操作程序補：原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子

RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。補：真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子

外顯子

能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子

不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子內(nèi)含子：外顯子：真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細胞與真核細胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建

3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因請舉出三個以上的例子2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴增(PCR儀)（3）人工合成（DNA合成儀）目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因,獲取目的基因是實施基因工程的第一步

。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。(一)從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1.基因文庫基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系2.基因組文庫的構(gòu)建供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接受體細胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴增目的基因分離用限制酶切斷成許多片段①鳥槍法：(直接分離法)反轉(zhuǎn)錄法目的基因的mRNA含目的基因mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高3.cDNA

文庫的構(gòu)建②反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)3.cDNA

文庫的構(gòu)建③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成3.cDNA

文庫的構(gòu)建上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因?qū)Ｒ恍詮姴僮鬟^程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因思考:為什么要構(gòu)建基因文庫?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA自動測序儀：2）PCR技術(shù)：對提取出來的基因進行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增。(二)利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR技術(shù)擴增目的基因PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) ①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________(做啟動子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增(二)利用PCR技術(shù)擴增目的基因⑥過程：a、DNA變性（95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（72℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈(三)直接人工合成通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成DNA合成儀

根據(jù)已知的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料直接合成目的基因。僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴增利用化學(xué)方法人工合成一、目的基因的獲取1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同—核心二、基因表達載體的構(gòu)建質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種4.過程:5.基因表達載體的組成：復(fù)制原點、目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因它們各有什么作用?基因表達載體的構(gòu)建

1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。

2）用限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。

3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ恨r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍2、將目的基因?qū)雱游锛毎?）方法：顯微注射法（2）程序：3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?）思考：為什么選用微生物作為受體細胞？（2）方法：受體細胞為受精卵Ca2+

感受態(tài)細胞

1）將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性。

2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入受體細胞。

3）目的基因在受體細胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。將目的基因?qū)胛⑸?/p>

受體細胞中真正攝入了含目的基因的重組質(zhì)粒很少，必須將它從中檢測出來。利用標(biāo)記基因（抗生素抗性基因）進行篩選。過程如下：

1.選擇不含標(biāo)記基因的大腸桿菌，并用Ca2+處理受體細胞。

2.將“重組質(zhì)?！迸c上述大腸桿菌在緩沖液中混合培養(yǎng)。

3.將每個受體細胞單獨培養(yǎng)在含抗生素的培養(yǎng)基上，有菌落出現(xiàn)則說明導(dǎo)入“重組質(zhì)?！背晒?。

重組質(zhì)粒的導(dǎo)入是否成功呢？進一步檢測菌落中是否有目的基因的”表達產(chǎn)物”。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。檢測—鑒定—①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲或抗病鑒定、功能活性鑒定方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交四、目的基因的檢測與鑒定DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定分別提取什么進行檢測歸納步驟①從人體中克隆出胰島素基因的編碼序列(cDNA);②將cDNA前接上在大腸桿菌質(zhì)粒中，構(gòu)建成一個表達載體（含四環(huán)素抗性基因）;③將表達載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中,然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌.若表達載體未進入大腸桿菌,會因無抗四環(huán)素基因而死亡;若培養(yǎng)基上長出大腸桿菌,說明胰島素基因已進入了大腸桿菌中;④培養(yǎng)含有胰島素基因的大腸桿菌,收集菌體,破碎后從中提取人的胰島素.試敘述大腸桿菌如何產(chǎn)生人的胰島素過程？1.目的基因的獲?、購幕蛭膸熘蝎@取(建庫的方法：直接分離法、反轉(zhuǎn)錄法、根據(jù)已知氨基酸合成DNA法)②利用PCR技術(shù)擴增③化學(xué)方法人工合成2.構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（植物）、顯微注射技術(shù)（動物）、微生物4.目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：抗性鑒定、功能活性鑒定本節(jié)總結(jié)1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體

C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C典型例題2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、有多個限制酶切點

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（

）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A4）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細胞

D、目的基因的檢測和表達C基因工程的應(yīng)用一、植物基因工程碩果累累植物基因工程技術(shù)：1.提高農(nóng)作物的抗逆能力

2.改良農(nóng)作物的品質(zhì)

3.利用植物生產(chǎn)藥物1.抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲棉葉子正常棉葉子使用化學(xué)農(nóng)藥的缺點：造成環(huán)境污染損害人類健康增加生產(chǎn)成本

用于殺蟲的基因主要是：Bt毒蛋白基因蛋白酶抑制劑基因淀粉酶抑制劑基因植物凝集素基因等2.抗病轉(zhuǎn)基因植物抗煙草花葉病毒轉(zhuǎn)基因甜椒抗病毒轉(zhuǎn)基因西葫蘆抗病轉(zhuǎn)基因植物所采用的基因：病毒外殼蛋白基因病毒的復(fù)制酶基因抗真菌的基因：幾丁質(zhì)酶基因抗毒素合成基因3.其他抗逆轉(zhuǎn)基因植物耐寒、耐旱轉(zhuǎn)基因水稻4.利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)含大量維生素的轉(zhuǎn)基因玉米抗癌抗衰老的紫色西紅柿轉(zhuǎn)入維生素A合成酶基因的大米轉(zhuǎn)基因矮牽牛轉(zhuǎn)基因藍玫瑰轉(zhuǎn)入熒光酶的轉(zhuǎn)基因煙草苗1.用于提高動物生長速度二、動物基因工程前景廣闊轉(zhuǎn)入外源生長激素基因的“超級小鼠”

2.用于改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)“乳糖不耐癥”乳糖含量低的奶牛：將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M3.用轉(zhuǎn)基因的動物生產(chǎn)藥物人治療性抗體轉(zhuǎn)基因奶牛含有人凝血因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗凝血酶Ⅲ蛋白4.用轉(zhuǎn)基因的動物作器官移植的供體導(dǎo)入人基因具特殊用途的豬和小鼠三、基因工程藥品異軍突起基因工程肝炎疫苗基因工程藥物發(fā)酵設(shè)備胰島素是治療糖尿病的特效藥。一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家畜的胰腺中提取，一名糖尿病患者每年需用的胰島素需要從40頭牛或50頭豬的胰臟中才能提取到。1978年，科學(xué)家將動物體內(nèi)的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，用2000ml大腸桿菌發(fā)酵液得到100kg胰島素。1982年，美國一家基因公司用基因工程方法生產(chǎn)的胰島素投入市場，售價降低了30%~50%?；蚬こ趟幤贰葝u素

治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。治療一名侏儒癥患者每年需要從80具尸體的腦下垂體中提取生長激素?，F(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長激素。人們從450L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當(dāng)于6萬具尸體的全部產(chǎn)量?；蚬こ趟幤贰L激素干擾素是病毒侵入細胞后產(chǎn)生的一種糖蛋白。干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一種抗病毒的特效藥。此外干擾素對治療某些癌癥和白血病也有一定療效。傳統(tǒng)的干擾素生產(chǎn)方法是從人血液中的白細胞內(nèi)提取，每300L血液只能提取出1mg干擾素。1980~1982年，科學(xué)家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細胞內(nèi)獲得了干擾素，是傳統(tǒng)的生產(chǎn)量的12萬倍。1987年上述干擾素大量投放市場?；蚬こ趟幤贰蓴_素基因工程干擾素傳統(tǒng)疫苗存在許多缺點：生產(chǎn)過程需大量繁殖病原體，對工作人員健康造成很大威脅；病原體的減毒、滅活有可能不夠徹底，導(dǎo)致接種者直接感染?；蚬こ桃呙纾簩⑵痍P(guān)鍵作用的、序列保守的蛋白質(zhì)基因重組到細菌或真核細胞內(nèi)，生產(chǎn)蛋白質(zhì)，制作成疫苗。它不使用病原體本身，所以安全，還可以把不同病原體的抗原基因重組到同一受體細胞，生產(chǎn)多價疫苗?；蚬こ趟幤贰蚬こ桃呙缁蚬こ贪滩∫呙缁蚬こ桃腋我呙缁蛟\斷：也稱為DNA診斷或基因探針技術(shù)，即在DNA水平分析檢測某一基因，從而對特定的疾病進行診斷。探針制備：放射性同位素(如32P)、熒光分子等標(biāo)記的DNA分子；原理：利用DNA分子雜交原理；四、基因治療曙光初照基因探針：基因探針就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列。它包括整個基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。DNA分子雜交原理：

DNA分子雜交是基因診斷最基本的方法之一。其基本原理是：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補配對進行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核苷酸序列作為探針，與被測基因進行接觸，若兩者的堿基完全配對成雙鏈，則表明被測基因中含有已知的基因序列。基因診斷技術(shù)在什么方面發(fā)展迅速？在診斷遺傳性疾病方面發(fā)展迅速。目前已經(jīng)可以對幾十種遺傳病進行產(chǎn)前診斷。

1）β—珠蛋白的DNA探針→鐮刀狀細胞貧血癥

2）苯丙氨酸羧化酶基因探針→苯丙酮尿癥

3）白血病患者細胞中分離出的癌基因制備的DNA探針→白血病舉例基因治療：把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段。是指是把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募毎?，達到治療疾病的目的?；及肴樘茄Y的患者，由于細胞內(nèi)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶，使過多的半乳糖在體內(nèi)積聚，引起肝、腦等功能受損。

1971年，美國科學(xué)家在體外做了試驗，用帶有半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的噬菌體侵染患者的離體組織細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些組織細胞能夠利用半乳糖了。這表明，用基因替換的方法治療這種遺傳病是可能的。首例基因治療的受益者

（美國1990年）到1998年底，世界范圍內(nèi)累計3134人接受了基因轉(zhuǎn)移試驗1990年美國國立衛(wèi)生研究院治愈一位“重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合癥”的4歲女孩基因治療：用一個正常的基因來代替缺陷基因ADA基因缺陷ADA：腺苷酸脫氨酶基因治療的分類體外基因治療：先從病人體內(nèi)獲取某種細胞，例如T淋巴細胞，進行培養(yǎng)，然后，在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細胞擴增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)。體內(nèi)基因治療：直接向人體組織細胞中轉(zhuǎn)移基因的治病方法?；蚬こ膛c食品業(yè)基因工程為人類開辟新的食物來源。

1）雞蛋白基因在大腸桿菌和酵母菌中表達獲得成功。這表明，未來能用發(fā)酵罐培養(yǎng)的大腸桿菌或酵母菌來生產(chǎn)人類所需要的卵清蛋白。

2）用基因工程的方法從微生物中獲得人們所需要的糖類、脂肪和維生素等產(chǎn)品?；蚬こ虨槭称饭I(yè)中提供了什么前景？基因工程與環(huán)境保護1）用于環(huán)境監(jiān)測。2）用于被污染環(huán)境的凈化?；蚬こ淘诃h(huán)保方面有什么應(yīng)用？例如：用DNA探針可以檢測飲用水中病毒的含量。此方法的特點是快速、靈敏，1噸水中有10個病毒也能檢測出來。通過基因工程方法怎樣進行環(huán)境監(jiān)測？

1）用基因工程產(chǎn)物——“超級細菌”分解石油，可以大大提高細菌分解石油的效率。具體方法：將能分解三種烴類的假單孢桿菌的基因都轉(zhuǎn)移到能分解另一種烴類的假單孢桿菌內(nèi)，創(chuàng)造出了能同時分解四種烴類的“超級細菌”。

2）用基因工程培養(yǎng)出“吞噬”汞和降解土壤中DDT的細菌，以及能夠凈化鎘污染的植物。

3）通過基因重組構(gòu)建新的殺蟲劑，取代生產(chǎn)過程中耗能多、易造成環(huán)境污染的農(nóng)藥，并試圖通過基因工程回收和利用工業(yè)廢物。通過基因工程方法怎樣凈化被污染的環(huán)境？蛋白質(zhì)是一切生命活動的體現(xiàn)者基因控制蛋白質(zhì)的合成活動1：如果想讓某一個生物的性狀在另外一個生物的身上表達，常用的方法有哪些？

要想讓一種生物的性狀在另一種生物中表達，在種內(nèi)可以用常規(guī)雜交育種的辦法實現(xiàn)，但要使有生殖隔離的種間生物實現(xiàn)基因交流，就顯得力不從心了?；蚬こ痰恼Q生，為克服這一遠緣雜交的障礙問題，帶來了新的希望?；蚬こ坛晒S碩植物方面提高植物的抗蟲、抗病、抗逆性改良植物的品質(zhì)動物方面提高動物生長速度改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物用轉(zhuǎn)基因動物作器官移植的供體研制藥物基因治療基因工程原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。生物產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)是在長期進化過程中形成的，它的結(jié)構(gòu)、性能不能完全滿足人類生產(chǎn)和生活的需要。于是要對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，制造出目前從天然蛋白質(zhì)中找不到的蛋白質(zhì)。這樣人們又開始了新一輪的探索，蛋白質(zhì)工程應(yīng)運而生了。一、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由干擾素用于治療病毒的感染和癌癥，但在體內(nèi)不易保存，如果將它的一個半胱氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸，則可在-700C條件下保存半年。為什么要開展蛋白質(zhì)工程？玉米中賴氨酸的含量比較低在已研究過的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因為工業(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會有酸、堿或有機溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會很快變性失活。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個非常重要的課題。一般來說，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括：延長酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。例如：改造干擾素（半胱氨酸）體外很難保存干擾素（絲氨酸）體外可以保存半年玉米中賴氨酸含量比較低天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（異亮氨酸）二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍對天然蛋白質(zhì)進行改造，你認為應(yīng)該直接對蛋白質(zhì)分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？答：應(yīng)該從對基因的操作來實現(xiàn)對天然蛋白質(zhì)改造，主要原因如下：（1）任何一種天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼的，改造了基因即對蛋白質(zhì)進行了改造，而且改造過的蛋白質(zhì)可以遺傳下去。如果對蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造過的蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳的。（2）對基因進行改造比對蛋白質(zhì)直接改造要容易操作，難度要小得多。二、蛋白質(zhì)工程的概念蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類對生產(chǎn)和生活的需求。前提：了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系空間結(jié)構(gòu)的測定：X射線晶體衍射法、核磁共振（一級結(jié)構(gòu)的測定（氨基酸序列））蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)胰島素的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)血紅蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)

血紅蛋白分子就是由二個由141個氨基酸殘基組成的α亞基和二個由146個氨基酸殘基組成的β亞基按特定的接觸和排列組成的一個球狀蛋白質(zhì)分子，每個亞基中各有一個含亞鐵離子的血紅素輔基。關(guān)鍵技術(shù)：基因工程蛋白質(zhì)工程稱為第二代基因工程目的：定向改造或制造蛋白質(zhì)原理：改造基因（基因修飾或基因合成）三、蛋白質(zhì)工程的基本原理根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定要求，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行分子設(shè)計。由于基因決定蛋白質(zhì)，要對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行設(shè)計改造，必須從基因入手?；虮磉_流程圖蛋白質(zhì)工程流程圖從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測應(yīng)有的氨基酸序列找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列討論：1、怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請把相應(yīng)的堿基序列寫出來。活動2某多肽鏈的一段氨基酸序列是：……-丙氨酸-色氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-……丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG色氨酸：UGG賴氨酸：AAA、AAG甲硫氨酸：AUG苯丙氨酸：UUU、UUC

每種氨基酸都有對應(yīng)的密碼子，只要查一下遺傳密碼子表，就可以將上述氨基酸序列的編碼序列查出來。但是由于上述氨基酸序列中有幾個氨基酸是由多個密碼子編碼，因此其堿基排列組合起來就比較復(fù)雜，至少可以排列出1