TGXAS-桑樹(shù)熒光定量RT-PCR檢測(cè)操作規(guī)程

Q/LB.□XXXXX-XXXX前言本文件參照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站提出、歸口并宣貫。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣站、百色市蠶業(yè)站、廣西南寧天龍生物科技有限公司。本文件主要起草人：劉丹、黃勝、邱長(zhǎng)玉、林強(qiáng)、韋偉、張朝華、陸曉媚、曾燕蓉、朱光書(shū)、黃瓊玲、崔秋英、冉艷萍。桑樹(shù)熒光定量RT-PCR檢測(cè)操作規(guī)程范圍本文件界定了熒光定量RT-PCR檢測(cè)操作相關(guān)的術(shù)語(yǔ)和定義，給出了材料處理、RNA提取、cDNA的合成、內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)、桑樹(shù)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序、基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法等操作指示。本文件適用于逆境脅迫下桑樹(shù)功能基因熒光定量RT-PCR檢測(cè)操作等技術(shù)。規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。熒光定量RT-PCRReal-timequantitativeRT-PCR將熒光標(biāo)記物加入PCR體系，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的同時(shí)，熒光標(biāo)記物也同比例擴(kuò)增，通過(guò)儀器讀取整個(gè)時(shí)期熒光信號(hào)強(qiáng)度即可了解產(chǎn)物的實(shí)時(shí)擴(kuò)增情況，并對(duì)待測(cè)樣品的初始模板進(jìn)行定量或定性分析。

熒光閾值threshold在熒光信號(hào)檢測(cè)中,為了區(qū)分背景噪聲和真實(shí)信號(hào)而設(shè)置的一個(gè)閾值。

Ct值Thevalueofcyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

內(nèi)參基因Referencegene在細(xì)胞中的表達(dá)量或者在基因組中的拷貝數(shù)相對(duì)恒定。

相對(duì)定量分析Relativequantitativeanalysis測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例，不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。材料處理4.1苗木準(zhǔn)備利用水培法培養(yǎng)桑樹(shù)種子直至種子生根發(fā)芽后將其種植在含有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，放置于PQX植物培養(yǎng)箱中，溫度為26℃，光周期為12h，直到地上部分長(zhǎng)至25cm～30cm，然后，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的用于后續(xù)逆境脅迫處理。4.2逆境脅迫處理以干旱處理為例，用8%PEG6000模擬干旱處理桑樹(shù)幼苗，分別于處理后0h、8h、24h、32h和48h后收獲并在–80℃儲(chǔ)存干旱處理過(guò)的葉片（每6盆植物作為一個(gè)樣品處理組）。用未經(jīng)處理的幼苗作為對(duì)照。RNA提取RNA提取的步驟如下：取100mg桑樹(shù)材料于研缽中加入液氮迅速研磨直至研磨成細(xì)粉；將研缽中的細(xì)粉迅速轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，加入1mLRNAisoPlus試劑或其他適用于提取桑葉總RNA的試劑，劇烈震蕩混勻，室溫靜置3min；12000rpm，4℃，離心5min；吸取上清液于新的1.5mL離心管中，加入上清液1/5體積氯仿，充分渦旋后室溫靜置5min；4℃，12000rpm，離心5min；吸取上清液于新的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min；4℃，12000rpm離心10min，此時(shí)，離心管底部可見(jiàn)RNA沉淀；棄上清液，加入1mL用DEPC(diethylpyrocarbonate，\t"/item/DEPC%E6%B0%B4/_blank"焦碳酸二乙酯)水配制的75%乙醇，輕柔上下顛倒幾次，4℃，12000rpm離心2min；重復(fù)步驟（h），離心完畢后，棄上清液，敞開(kāi)蓋子室溫干燥；加入適量DEPC水溶解RNA；用Nanodrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量，純RNAOD260nm/OD280nm的比值為2.0，OD260nm/OD280nm的比值范圍在1.8～2.1之間可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。cDNA的合成cDNA第一鏈的合成使用TcDNA第一鏈的合成使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimerScriptRTreagentKit）或其他公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，步驟如下：消化DNA：在RnasefreePCR管中加入如下試劑：5×gDNAEraserBuffer2μL、gDNAEraser1μL、TotalRNA1μg，所有組分加入完畢后，用移液槍輕輕吹打混勻，瞬時(shí)離心后42℃處理2min，立即放到冰上；反轉(zhuǎn)錄RNA：在第一步的樣品中依次加入如下試劑：ReactionsolutionfromStep110μL、RnasefreeddH2O4μL、5×PrimerScriptBuffer24μL、RTPrimerMix1μL、PrimerScriptRTEnzymeMixI1μL，用移液槍輕輕吹打混勻，瞬時(shí)離心，按如下程序進(jìn)行反應(yīng)：37°C15min；85°C5s；4℃∞。反應(yīng)完畢后，取出樣品，-20℃保存。內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank已公布的桑樹(shù)Actin3基因序列，用Primerpremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物P1：5′-CTATGTATGTCGCCATCCAGG-3′；下游引物P2：5′-TTCAGGGCATCGGAATCTC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為386bp。桑樹(shù)熒光定量RT-PCR反應(yīng)程序以桑樹(shù)的cDNA為模板，qPCR體系如下：SYBRPremix10μL、gene-specificprimers1.0μL、RoxReferenceDye2.0μL、模板2.0μL、ddH2O5.0μL、Total20μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，35～45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量