TGXAS-桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程編制說明

PAGEPAGE1團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》編制說明-征求意見稿一、項目來源根據(jù)廣西標準化協(xié)會《關于下達2022年第八十批團體標準制定項目計劃的通知》（桂標協(xié)〔2022〕196號）文件精神，由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站提出，廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站起草的團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》（項目編號：2022-8005）。二、項目背景和目的意義我國是世界蠶業(yè)起源中心，也是世界上桑樹種質(zhì)資源最為豐富的國家。廣西又是全國蠶桑第一大省。廣西于2005年起蠶繭產(chǎn)量成為全國第一大省，2006年起桑園面積成為全國第一大?。▍^(qū)）。2016-2021年，全區(qū)桑園面積基本穩(wěn)定在300萬畝，占全國桑園面積的25%左右。蠶繭產(chǎn)量40萬噸，年蠶繭產(chǎn)值平均值為157.5億元，連續(xù)16年位居全國第一。蠶桑產(chǎn)業(yè)已成為農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效和促進社會主義新農(nóng)村建設、構建富裕文明和諧新廣西的一大亮點,極大促進了廣西鄉(xiāng)村振興和精準扶貧。而桑樹青枯病卻嚴重阻礙著廣西桑樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。桑樹青枯病、赤銹病以及菌核病等嚴重危害著蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。選育抗病品種是防止桑樹染病的有效措施,而抗病育種成敗的關鍵則是抗性基因的挖掘及其功能研究。與此同時，桑樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展必須解決好保護現(xiàn)有耕地以及與糧食種植爭地的問題。廣西是中國喀斯特地貌的典型地區(qū)，喀斯特地貌面積約占廣西總面積的37%，由于桑樹良好的生態(tài)適應特性，使得在喀斯特地貌地區(qū)等干旱、鹽堿地和石漠化地區(qū)栽培桑樹成為可能及，如此不但能有效地保護現(xiàn)有耕地，而且也能獲得良好的生態(tài)經(jīng)濟效益。因此對桑樹耐旱、耐鹽堿關鍵基因的挖掘及，將有助于進一步拓寬桑樹的種植面積，進一步促進廣西桑樹產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效。綜上，需要一種快速檢測桑樹抗性基因功能的方法。實時熒光定量技術是實時熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種新的定量技術，將熒光標記物加入體系，PCR擴增的同時，熒光標記物也同比例擴增，通過儀器讀取整個時期熒光信號強度即可了解產(chǎn)物的實時擴增情況，并對待測樣品的初始模板進行定量或定性分析。韋燕梅等利用熒光定量PCR分析了MaMYB308基因在高溫、低溫、高鹽和干旱等非生物脅迫下的轉錄水平，結果表明MaMYB308基因均有響應,其中對低溫脅迫誘導最為顯著,表達量為對照的40倍左右。研究結果為進一步研究桑樹MaMYB308基因的生物學功能及桑樹的抗逆機理提供了幫助。本標準規(guī)定桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程的術語和定義及RT-PCR檢測方法,對抗病及抗旱等抗逆性強的桑樹品種分子選育提供一定指導意義。受氣候、技術、市場、環(huán)境等因素的影響，我國蠶桑生產(chǎn)依然面臨著家蠶微粒子病、桑樹病蟲害、自然災害等因素所造成的生產(chǎn)風險。通過傳統(tǒng)育種方法和現(xiàn)代分子育種技術相結合，開展優(yōu)質(zhì)、高抗等桑樹品種選育。利用熒光定量PCR技術可以快速分析不同逆境脅迫下基因的表達差異，能夠快速了解基因的初步功能,對桑樹的分子育種提供了基因源及研究方向。但是有關桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程目前尚沒有國家標準和地方標準，為了規(guī)范桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程，確?？焖?、高效的桑樹基因功能檢測技術，促進桑樹抗逆品種選育，我站申請制定《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》。三、項目編制過程（一）成立標準編制工作組團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》項目任務下達后，廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站成立了標準編制工作組，制定了標準編寫方案，明確任務職責，確定工作技術路線，開展標準編制工作，具體標準編制工作由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站相關人員配合。（二）收集整理文獻資料編制工作小組成員根據(jù)任務分工進行了資料收集和調(diào)查研究分析，一是收集國內(nèi)國外相關的法律法規(guī)和技術標準，了解逆境脅迫下桑樹功能基因熒光定量RT-PCR檢測技術等方面的相關資料；二是組織技術人員到相關企業(yè)、科研院所進行實地考察，了解并掌握當前RT-PCR檢測技術的情況，提高標準的適應性和普遍性，為我區(qū)菜用桑種植普遍適用的技術依據(jù)。標準編制工作組收集了國內(nèi)有關桑樹功能基因熒光定量RT-PCR檢測的相關技術文獻資料。主要有：DB14/T1414桑樹播種育苗技術規(guī)程DB21/T2395-2015稻蘊病菌無毒基因檢測PCR法DB21/T2396-2015水稻品種抗稻瘟病基因檢測PCR法DB37/T1019-2008大豆及其制品中抗草甘膦轉基因成分的實時熒光定量PCR檢測方法DB45/T86-2003桑樹栽培管理技術規(guī)程DB53/T944-2019甘派抗褐銹病基因Brul的PCR檢測技術DB65/T4215桑樹育苗技術規(guī)程S/T2271-2009青椒中?；虺煞侄ㄐ訮CR檢測方法研討確定標準主體內(nèi)容2022年11月，廣西標準化協(xié)會下達《關于下達2022年第八十批團體標準制定項目計劃的通知》（桂標協(xié)〔2022〕196號）文件，根據(jù)文件精神，《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》立項（項目編號：2022-8005）。2023年1-3月，成立標準起草編寫小組，明確任務分工；編制標準制定技術設計和實施方案；標準相關資料收集、調(diào)查和研究工作，通過理清邏輯脈絡，整合已有的參考資料中有關桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作的內(nèi)容指標，并結合桑樹熒光定量RT-PCR檢測技術實際要求的基礎上，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成了團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》（草案）。2023年4-5月，向區(qū)內(nèi)涉及領域的部門及相關專家征求團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》（草案）意見。2023年6月，標準組深入廣西各地實地調(diào)研，并實地征求團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》（草案）意見。2023年7-8月，標準編制工作組在廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站會議室組織涉及的部門專家對團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》（草案）進行征求意見會。最終討論形成團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》（征求意見稿）和編制說明。報送廣西標準化協(xié)會進行網(wǎng)上征求意見。四、標準制定原則（一）實用性原則本文件中有關桑樹RT-PCR檢測技術內(nèi)容及要求的規(guī)定，是在充分收集相關資料和文獻，分析桑樹RT-PCR檢測技術當前現(xiàn)狀，調(diào)研區(qū)內(nèi)RT-PCR檢測技術的基礎上，進行制定。堅持從我區(qū)豐富的農(nóng)業(yè)資源條件和市場需求出發(fā)，綜合考慮我區(qū)桑樹的生長發(fā)育特點，分析技術風險性，使之具有較強的實用性和指導性。本標準對材料處理、RNA提取、cDNA的合成、內(nèi)參基因的引物設計、桑樹熒光定量RT-PCR反應程序、基因相對表達量計算方法等操作進行了更科學的規(guī)范，主要環(huán)節(jié)、關鍵技術已反復驗證，使之簡單易行，便于操作。符合當前區(qū)內(nèi)桑樹RT-PCR檢測技術發(fā)展水平，具有較強的實用性和可操作性。（二）協(xié)調(diào)性原則本文件在標準編寫過程中注意了與桑樹RT-PCR檢測技術相關法律法規(guī)、標準的協(xié)調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標準協(xié)調(diào)一致。（三）規(guī)范性原則本文件嚴格按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本文件的內(nèi)容，保證標準的編寫質(zhì)量。（四）前瞻性原則本文件在兼顧當前區(qū)內(nèi)桑樹RT-PCR檢測技術的現(xiàn)實情況的同時，還考慮到了桑樹RT-PCR檢測技術的需要，在標準中體現(xiàn)了個別特色性、前瞻性和先進性條款，作為對菜用桑行業(yè)發(fā)展的引導。五、標準主要章節(jié)內(nèi)容及確定依據(jù)團體標準《桑樹熒光定量RT-PCR檢測操作規(guī)程》主要章節(jié)內(nèi)容包括：材料處理、RNA提取、cDNA的合成、內(nèi)參基因的引物設計、桑樹熒光定量RT-PCR反應程序、基因相對表達量計算方法等操作進行了更科學的規(guī)范。項目以廣西蠶桑產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的重大科學問題和關鍵技術問題為導向，針對桑樹生產(chǎn)的分子育種，針對性設計及檢測方法。研究主要集中在桑樹抗逆基因的表達譜分析及篩選等方面。本研究室采用實時定量PCR（RT-qPCR）研究了干旱、UV、病原體、激素等處理下桑樹PPO、MnSPDS、CCD、NCED等基因的表達模式。與標準生長環(huán)境相比，這些基因的mRNA水平在逆境脅迫處理中表現(xiàn)出顯著變化，這些發(fā)現(xiàn)為桑樹在脅迫反應中的信號轉導的分子基礎提供了有用的參考信息。以這些研究結果為基礎成功發(fā)表了5篇SCI論文。苗木準備利用水培法培養(yǎng)桑樹種子直至種子生根發(fā)芽后將其種植在含有營養(yǎng)土的花盆中，放置于PQX植物培養(yǎng)箱中，溫度為26℃，光周期為12h，直到地上部分長至25cm～30cm，然后，挑選長勢一致的用于后續(xù)逆境脅迫處理。只有挑選長勢一致的苗木作為實驗材料，后續(xù)實驗實驗結果才可信。材料逆境脅迫處理以干旱處理為例，用8%PEG6000模擬干旱處理桑樹幼苗，分別于處理后0、8、24、32和48h后收獲并在–80℃儲存干旱處理過的葉片（每6盆植物作為一個樣品處理組）。用未經(jīng)處理的幼苗作為對照。PEG6000誘導水份逆境所產(chǎn)生的效果與將土壤逐步干旱是一致的，而且PEG6000不會穿過細胞壁，化學性質(zhì)穩(wěn)定，對植物毒性小，比較適合干旱模擬。表1不同方法模擬干旱處理8h后SPDS1基因的表達量分析名稱PEG質(zhì)量分數(shù)/%相對表達量（處理1）相對表達量（處理2）相對表達量（處理3）三次處理平均值誤差PEG400041.320.931.651.300.36PEG400081.802.302.702.260.45PEG600041.101.501.801.470.35PEG600081.902.112.122.000.12從表1中可以看到，上述四種脅迫方法對桑SPDS1基因的表達量分析均產(chǎn)生了影響，從三次重復結果來看8%PEG6000模擬干旱的方法實驗結果誤差最小，結果穩(wěn)定，可重復性好。故選擇8%PEG6000模擬干旱脅迫。RNA提取及cDNA的合成RNA提取的步驟如下：a）取100mg桑樹材料于研缽中加入液氮迅速研磨直至研磨成細粉；b）將研缽中的細粉迅速轉移到1.5mL的離心管中，加入1mlRNAisoPlus試劑或其他適用于提取桑葉總RNA的試劑，劇烈震蕩混勻，室溫靜置3min；c）12000rpm，4℃，離心5min；d）吸取上清液于新的1.5ml離心管中，加入上清液1/5體積氯仿，充分渦旋后室溫靜置5min；e）4℃，12000rpm，離心5min；f）吸取上清液于新的1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10min；g）4℃，12000rpm離心10min，此時，離心管底部可見RNA沉淀；h）棄上清液，加入1ml用DEPC(diethylpyrocarbonate，\t"/item/DEPC%E6%B0%B4/_blank"焦碳酸二乙酯)水配制的75%乙醇，輕柔上下顛倒幾次，4℃，12000rpm離心2min；i）重復步驟（8），離心完畢后，棄上清液，敞開蓋子室溫干燥；j）加入適量DEPC水溶解RNA；k）用Nanodrop2000分光光度計檢測RNA濃度和質(zhì)量，純RNAOD260nm/OD280nm的比值為2.0，OD260nm/OD280nm的比值范圍在1.8-2.1之間可進行下一步實驗。cDNA的合成cDNA第一鏈的合成使用TcDNA第一鏈的合成使用Takara反轉錄試劑盒（PrimerScriptRTreagentKit）或其他公司的反轉錄試劑盒，步驟如下：a）消化DNA在RnasefreePCR管中加入如下試劑：5×gDNAEraserBuffer2μl、gDNAEraser1μl、TotalRNA1μg，所有組分加入完畢后，用移液槍輕輕吹打混勻，瞬時離心后42℃處理2min，立即放到冰上；b）反轉錄RNA在第一步的樣品中依次加入如下試劑：ReactionsolutionfromStep110μl、RnasefreeddH2O4μl、5×PrimerScriptBuffer24μl、RTPrimerMix1μl、PrimerScriptRTEnzymeMixI1μl，用移液槍輕輕吹打混勻，瞬時離心，按如下程序進行反應：37°C15min；85°C5sec；4℃∞。反應完畢后，取出樣品，-20℃保存。以上步驟可根據(jù)具體試劑盒的說明書進行操作。實時熒光定量PCR技術特異性強、靈敏度高的特點，可定量極微量的基因表達或DNA拷貝數(shù)，但稍有不慎即可引起檢測結果較大的差異和極微量的污染，即可造成假陽性。其中，樣品的核酸提取步驟至關重要，強調(diào)樣本核酸提取的標準可以解決這一問題。故規(guī)范熒光定量PCR的RNA提取及cDNA的合成，將減少結果誤差，確?？焖佟⒏咝У纳浠蚬δ軝z測技術，促進桑樹抗逆品種選育，從而促進蠶桑產(chǎn)業(yè)的全國推廣，為鄉(xiāng)村振興添磚加瓦。內(nèi)參基因的確定及引物設計根據(jù)GenBank已公布的桑樹Actin3基因序列，用Primerpremier5.0軟件進行引物設計，上游引物P1：5′-CTATGTATGTCGCCATCCAGG-3′；下游引物P2：5′-TTCAGGGCATCGGAATCTC-3′。擴增片段長度為386bp。部分肌動蛋白基因達量較高且穩(wěn)定，因此常被用作基因表達分析的內(nèi)參。圖1肌動蛋白基因組織特異性表達分析（李軍等，2011）1：莖；2：葉；3：葉柄；4：托葉；5：韌皮部：6：表皮：7：果實：8：根。據(jù)圖1可知桑樹Actin3基因在桑樹各部位各個發(fā)育時期表達量很穩(wěn)定，可以作為桑樹基因表達研究的內(nèi)參基因。桑樹熒光定量RT-PCR反應程序以桑樹的cDNA為模板，qPCR體系如下：SYBRPremix10μl、gene-specificprimers1.0μl、RoxReferenceDye2.0μl、模板2.0μl、ddH2O5.0μl、Total20μl。反應程序：95℃預變性5min，95℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸10s，35-45個循環(huán)。每個樣品設3個生物學重復，每個生物學重復設3個技術重復。根據(jù)所用試劑盒的說明書進行操作?；蛳鄬Ρ磉_量計算方法使用2-ΔΔCt方法計算相對表達。ΔCt=（Ct目的基因-CtA3）;ΔΔCt=（ΔCt處理-ΔCt未處理）。“2-ΔΔCt對照=1”。如果“2-ΔΔCt目的基因>1”，則基因在