基因工程概述課件

（)基因工程首都師范大生命科學學院祁曉廷

（;qxt-）基因工程概述現(xiàn)代生物技術是解決人類面臨的困境的有效途徑基因工程概述基因工程的地位發(fā)酵工程

細胞工程酶工程

蛋白質工程

基因工程基因工程概述常用生物技術舉例干細胞技術：

恩同再造，無論換器官還是重生?；蛑委煟?/p>

遺傳物質的局部改變，亟待提高安全性。哺乳動物體細胞克隆技術：

開啟了一個人類無法預知的克隆人的大門，是福是禍？全基因組測序：

遺傳天書編排才開始，讀懂它尚需時日。單克隆抗體技術：

細胞全能性和細胞融合技術的完美結合。….基因工程概述干細胞技術基因工程概述基因治療技術基因工程概述1997年多利羊誕生使體細胞克隆哺乳動物成為可能基因工程概述多利和它的孩子基因工程概述人類基因組計劃--人類基因的破解基因工程概述基因工程

現(xiàn)代生物學技術的核心，是基因乾坤大轉移和大融合的技術基因工程概述基因工程概述基因工程應用微生物發(fā)酵：制備工業(yè)原料、食品添加劑等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)：動植物營養(yǎng)品質改良，提高抗逆性醫(yī)藥業(yè)：基因工程制藥（抗生素、疫苗、抗體等）軍事：生物武器航天：提高生物耐缺氧、耐輻射等性狀?；蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀鲋参锘蚬こ藺CC合成酶利用反義RNA技術，抑制乙烯合成的前體耐貯運對于番茄、草莓、香蕉、蘋果等果蔬最為重要基因工程概述基因工程概述

這些東西最好也不要出現(xiàn)！基因工程概述基因工程概述微生物基因工程基因工程概述轉基因植物基因工程概述番茄子葉分化

轉基因番茄的移栽

田間生長與結實

ELISA檢測轉基因植株HBsAg活性

轉基因番茄的PCR鑒定

乙型肝炎表面抗原在轉基因番茄中的表達基因工程概述體細胞核移植制備轉基因動物的基本過程基因工程概述胚胎干細胞的篩選和細胞移植培育轉基因動物的基本過程基因工程概述轉基因動物基因工程概述工具酶的總結基因工程概述克隆載體基因工程概述載體（Vector）的概念添加復制起始位點、啟動子和轉錄終止子可以解決“單獨”的外源基因在宿主細胞內不能復制表達甚至被降解的“杯具”。這一需求催生了--載體。

載體是攜帶外源基因在宿主細胞內完成的復制甚至表達人工構建的DNA分子。基因工程概述載體的分類根據(jù)用途可以分為：

克隆載體：在宿主細胞內高保真地大規(guī)模復制。測序載體：用于測定DNA序列。表達載體：用于外源基因的表達。盡管如此，“三合一”的載體目前經(jīng)常用。根據(jù)來源不同可以分為：質粒載體，病毒載體，人工染色體基因工程概述載體的基本條件1、能自我復制并能帶動插入的外源基因一起復制。2、具有合適的多種限制酶的單一切點。3、具有適宜的篩選標記。4、相對分子質量小，細胞內拷貝數(shù)要多。5、在細胞內穩(wěn)定性高，易分離純化?；蚬こ谈攀鲚d體結構多克隆位點，容許外源基因插入的合法位點宿主細胞能識別的復制起始序列，如果含有兩種以上復制起始位點，則為穿梭載體篩選標記：抗生素分解基因（Amp,Km等）、報告基因（GUS,GFP,LUC,LacZ）。這些基因多為組成型啟動子控制，恒定表達。啟動子（宿主細胞能識別的啟動子）終止子（轉錄終止序列，多來自宿主細胞病毒和細菌）基因工程概述體外重組

重組DNA向宿主細胞導入基因工程概述RecombinantDNA基因工程概述重組重組是通過T4DNA連接酶將目的DNA片段插入到載體相應位點的DNA重組過程。通過優(yōu)化連接參數(shù)可以獲得高的連接效果。具體如下：1.插入片段摩爾數(shù)要多于載體摩爾數(shù)（3-10倍）；2.平末端連接采用低溫（4-8度過夜），而黏性末端在室溫下連接幾小時或16度連接過夜。3.連接體系一般為10-20微升，體積過大過小會影響連接效率。4.可以用T4RNA連接酶連接單鏈的DNA分子?；蚬こ谈攀?/p>

體外重組線路圖基因工程概述導入重組體主要方法

物理學方法：微注射技術、基因槍技術、電轉化法（電穿孔術）、超聲波化學方法：CaCl2低滲轉化大腸桿菌、脂質體介導法、PEG介導生物媒介方法：病毒介導法、農(nóng)桿菌介導轉基因方法基因工程概述

轉化原理基因工程概述

負對照實驗組正對照基因工程概述藍白篩選結果基因工程概述根癌農(nóng)桿菌介導轉化植物的方法1.根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)的一般性質：

冠癭病Ti質粒（Tumorinducingplasmid)T-DNA(TramsferredDNA)區(qū)Vir區(qū)

基因工程概述

*冠癭瘤的特點：

激素自主性冠癭堿幻燈片5無正常分化能力*農(nóng)桿菌與Ti－質粒的類型：

章魚堿型（octopinetype）胭脂堿型（nopalinetype）農(nóng)桿堿型（agropinetype）

*冠癭堿可以分為四類：

章魚堿族胭脂堿族甘露堿族農(nóng)桿素基因工程概述基因工程概述OctopineVir

基因的基本結構與功能基因工程概述A:a.中間載體必須有T-DNA的同源序列，還有pBR的序列，進入農(nóng)桿菌后高頻同源重組b.要有細菌選擇標記基因，便于篩選共整合質粒c.陽性的這選擇標記基因d.單一的限制內切酶切點，多克隆位點e.無Ti質粒的邊界序列f.要有bom位點序列，可以在不同細菌細胞間轉移B.二元載體系統(tǒng)的中間載體特點：

a.無同源序列b.有LB和RBc.無cellEI復制點基因工程概述T-DNA的整個轉化過程基因工程概述缺失啟動子-GUS表達載體轉化煙草

對照抗性芽（Km:100ug/ml）生根的轉基因煙草苗（Km:100ug/ml）

轉化煙草土培苗開花的土培苗基因工程概述電轉化法（electrotransfortion）

也稱電穿孔術（electroporation）,是利用高壓脈沖瞬時放電，使電場中的細胞膜穿孔，位于溶液中的外源基因得以進入細胞。影響轉化率的因素很多，如：電場強度、電脈沖的長度、DNA的構象和濃度、培養(yǎng)液的離子成分等，需摸索反應條件，優(yōu)化各項參數(shù)。當電場強度和脈沖長度以一定方式組合而導致50％～70％細胞死亡時，轉化的水平達到最高。

特點：無受體細胞特異性，動、植物細胞，原核細胞均可；轉化率不穩(wěn)定，需摸索確定轉化條件；具有成套專用設備?；蚬こ谈攀鍪疽怆娂まD化基因工程概述微注射技術（microinjection）

用微吸管吸入供體DNA溶液，在顯微鏡下準確插入受體細胞核中，并將DNA注射進去。特點：多用于動物細胞；注射過程慢，技術要求高；有成套專用設備?；蚬こ谈攀鯠NA顯微注射示意圖

基因工程概述圖示微注射轉化的應用基因工程概述基因槍技術（geneblastertechnique）

利用一個高速推動力，加速重金屬粒子運動，使附著在重金屬粒子上的外源DNA隨同重金屬粒子一起射入靶細胞或組織內。一般把DNA包被在金?；蜴u粒上，用彈藥槍（化學推進劑為動力）和電子槍（以放電為動力）為工具將粒子向受體細胞轟擊。特點：無宿主特異性；能直接向細胞器中輸入DNA；轉化有壁的植物細胞有效；已有多種類型基因槍可供選用，還在不斷改進和發(fā)展?；蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀鲋|體介導法

（liposomemediatedgenetransfer）

脂質體（liposome人工膜泡）是由脂質雙分子層組成的環(huán)形封閉囊泡，無毒、無免疫原性。在體外，脂質體作為基因載體可將基因轉化到細菌、真菌、植物原生質體和動物細胞。利用脂質體導入基因，一般都要將DNA或RNA包囊于脂質體內，然后進行脂質體與細胞膜的融合，通過融合導入細胞。基因工程概述圖示脂質體介導的轉化基因工程概述篩選概述篩選是從眾多轉化子中鑒定出含有目的DNA片段的陽性克隆的過程。具體的篩選程序為：DNA導入宿主細胞?[抗性篩選,報告基因，營養(yǎng)缺陷篩選]轉化子?[藍白篩選]重組轉化子?[PCR篩選,核酸分子雜交，免疫選篩選]陽性轉化子?[測序]陽性克隆基因工程概述目的基因在哪里？基因工程概述獲得目的基因的策略1.化學直接合成（短基因，有錢）。2.同源基因RT-PCR(或PCR)直接獲得（全或部分序列已知）。3.文庫篩選法(構建一個高質量的通用文庫，采用核酸雜交或免疫學篩選基因)。4.從蛋白質出發(fā)的目的基因（蛋白質N端序列測序，隨后設計兼并引物聯(lián)合RT-PCR）。5.電子克?。ɑ跀?shù)據(jù)庫，步步為營）6.全基因組測序后預測（結合表達譜芯片可以高通量獲得表達發(fā)生變化的目的基因種類及其相對變化水平）。基因工程概述基因工程概述

元件基因元件—組裝成基因

載體元件—

多克隆位點克隆元件—

銜接物或人工接頭引物測序或PCR探針核酸分子雜交用基因工程概述化學合成基因工程概述基因工程概述基因序列已知基因工程概述同源蛋白基因基因工程概述文庫是將某一物種基因組DNA或cDNA以克隆的方式（質?；蚴删w）保存在大腸桿菌中的方式?；蚬こ谈攀龌蚬こ谈攀鰳嫿╟DNA文庫基因工程概述文庫篩選基因工程概述基因工程概述免疫學篩選基因工程概述目的基因表達基因工程概述目的基因在宿主細胞中的表達需具備如下幾個特點：1.完整的表達框（啟動子-核糖體結合位點-目的基因-標簽-轉錄終止子）。其中選擇組成型、組織器官特異性、發(fā)育特異性和環(huán)境誘導型啟動子可以控制目的基因的特殊表達模式的需求。原核表達需要用SD序列作為核糖體結合位點，而真核表達需要有帽子位點即可。2.控制表達水平，盡量減少蛋白產(chǎn)物對宿主細胞的正常生活的干擾，產(chǎn)生分泌蛋白是一個不錯的選擇，3.為了方便檢測和純化蛋白產(chǎn)物，可以表達一個融合標簽（HA、HISx6、C-Myc、Flag、GST等）。基因工程概述原核表達體系基因工程概述真核表達體系基因工程概述體外轉錄翻譯體系基因工程概述表達載體基因工程概述SDSofthelysateofuninducedandinducedhostbacteria

E.coli

BL21(DE3)containingthecontrolexpressionvectorortherecombinantexpressionvectorandthepurifiedrecombinantprotein.

M

proteinmarker,

1

lysate