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化學(xué)品基于精密動態(tài)暴露的口鼻吸入毒性試驗1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了采用精密動態(tài)暴露方式進行化學(xué)品口鼻吸入毒性試驗的試驗原則和試驗程序本標(biāo)準(zhǔn)適用于基于精密動態(tài)暴露的化學(xué)品口鼻吸入毒性試驗。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T21605化學(xué)品急性吸入毒性試驗方法GB/T21754化學(xué)品28天/14天重復(fù)劑量吸人毒性試驗方法GB/T21765化學(xué)品亞慢性吸人毒性試驗方法GB/T27824化學(xué)品急性吸入毒性固定濃度試驗方法GB/T28648化學(xué)品急性吸入毒性試驗一急性毒性分類法下列術(shù)語和定義適用于本文件固態(tài)顆粒或液態(tài)激高懸浮于氣體中形成的懸浮體,如液態(tài)或氣態(tài)的泡沫、糊劑或粉末。由物質(zhì)或混合物形成的能空氣中的固體顆粒,多呈不規(guī)則形狀,從小于1μm到100μm不等?;蛴梢后w的機械剪切速率形成,如噴霧、霧化、噴灑或發(fā)泡等在常溫和常壓下呈液態(tài)或固態(tài)的物質(zhì)或混合物所形成的氣體狀態(tài)。每單位體積空氣中的受試物質(zhì)量精密動態(tài)暴露precisedynamicexposure為一種精密控制暴露參數(shù)的動態(tài)的吸人暴露方式,一般采用機械通風(fēng)裝置,連續(xù)不斷地將含有一定濃度受試樣品的空氣均勻不斷地送入吸入暴露系統(tǒng),并排出等量的染毒氣體,維持相對穩(wěn)定的染毒濃度。染毒過程中流入吸入暴露系統(tǒng)的氣體體積應(yīng)略大于流出的氣體體積,并保持這種狀態(tài)。染毒過程中保持暴露腔室內(nèi)溫度范圍22℃±3℃,相對濕度范圍30%~70%,受試物氣溶膠的粒徑大小范采用精密動態(tài)暴露方式進行化學(xué)品口鼻吸入毒性試驗。按照GB/T21605、GB/T28648或GB/T27824進行急性吸入毒性試驗;按照GB/T21754進行重復(fù)劑量吸入毒性試驗;按照GB/T21765進行亞慢性吸入毒性試驗。5試驗方法5.1試驗動物5.1.1動物品系的選擇嚙齒動物首選大鼠,使用其他嚙齒動物或使用非嚙齒動物時應(yīng)說明理由。5.1.2飼養(yǎng)條件動物房的溫度應(yīng)為22℃±3℃,相對濕度應(yīng)大于30%,相對濕度最好不要超過70%除非在清洗動物房時,50%~60%最合適。應(yīng)采用人工照明,12h明暗交替。實驗室常規(guī)飼料喂養(yǎng),飲水不限。在染毒前和染毒后,動物按性別或染毒濃度分籠飼養(yǎng),每籠的動物數(shù)以不干擾對每只動物的觀察為宜染毒過程中,每只動物置于單獨的籠中并禁食、水。5.1.3數(shù)量和性別按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范進行試驗動物數(shù)量和性別的選擇。5.1.4試驗動物準(zhǔn)備開始染毒前動物飼養(yǎng)觀察至少5d以適應(yīng)實驗室環(huán)境。動物隨機分組、編號。在開始染毒前,動物也應(yīng)在吸入染毒裝置內(nèi)短暫適應(yīng)一會兒,以降低環(huán)境改變而造成的動物緊張采用精密動態(tài)暴露方式進行口鼻吸入暴露??诒侨径痉绞娇勺畲蟪潭鹊販p少經(jīng)非吸入途徑吸收受試物,便于在高濃度受試物染毒時不需要大量使用受試物;另外,使用口鼻染毒方式時就不太需要考慮受試物穩(wěn)定性改變(例如與尿、糞等排泄物發(fā)生反應(yīng)或受潮濕環(huán)境影響而改變穩(wěn)定性)以及受試物氣溶膠在吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)分布不均勻等方面的問題??诒鞘奖┞妒菍游镏糜诠潭ㄆ鲀?nèi)進行染毒,原理見圖1。固定器應(yīng)不對動物產(chǎn)生額外的應(yīng)激(如由于固定器發(fā)熱所產(chǎn)生的熱應(yīng)激)并應(yīng)確保動物無法避開吸入染毒。應(yīng)將吸入暴露系統(tǒng)置于通風(fēng)良好的化學(xué)通風(fēng)櫥中,或?qū)⑽氡┞断到y(tǒng)置于單獨的一問房間內(nèi),要保證通風(fēng)榻或房間內(nèi)部處于負(fù)壓狀態(tài)以防止受試物泄露到外部環(huán)境中。要保證通風(fēng)櫥內(nèi)部處于負(fù)壓狀態(tài)以防受試物泄漏到外部環(huán)境中。氧含量應(yīng)至少為19%但最高不要超過24%,并要保證每只動物有類似的染毒條件。在采集氣溶膠樣本時,應(yīng)避免過度影響動態(tài)氣流。應(yīng)調(diào)整采樣流量的3大小以保證吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)條件不變。圖1口鼻式吸入暴露的原理圖5.3染毒條件5.3.1染毒時間5.3.1.1按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范設(shè)定染毒時間。5.3.1.2需要注意是在吸入暴露系統(tǒng)中受試物濃度達到平衡后開始計染毒時間。有特殊要求時。也可延長或縮短染毒時間,但應(yīng)說明理由。5.3.2染毒濃度5.3.2.1按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范確定染毒濃度。5.3.2.2為確保達到所要求的染毒濃度,應(yīng)在不使用動物的情況下先進行一次染毒操作,檢測一下染毒濃度并注意操作方面的關(guān)鍵問題。由于技術(shù)上很難保證吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)的受試物濃度正好是所要求的染毒濃度,為防止進行不必要的重復(fù)試驗,如吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物濃度均值在所要求濃度的±25%以內(nèi),則被認(rèn)為是可接受的5.3.23如果受試物具有潛在的爆炸性,應(yīng)特別注意一些可能引起爆炸的危險條件。5.4受試物題粒大小由于很難預(yù)知呼吸道的哪個部位對受試物反應(yīng)最強以及受試物粒徑多大時危害最大,粉塵或氣溶膠的顆粒大小應(yīng)能保證其到達呼吸道的每個區(qū)域。推薦受試物氣溶膠的粒徑大小范圍為空氣動力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑(MMAD)1μm-4jum.幾何標(biāo)準(zhǔn)差(GSD)1.5~3.0,這樣可保證整個呼吸道都可接觸到受試物。如染毒所用氣溶膠不符合上述粒徑大小,則應(yīng)解釋其合理性。如受試物顆粒具有吸濕性,則應(yīng)制備更小粒徑的顆粒,保證其在吸濕脹大后的粒徑仍然在1μm~4μm范圍內(nèi)。5.5受試物氣溶膠的發(fā)生必要時,可在受試物中加入適當(dāng)?shù)娜軇﹣韼椭茉囄镞_到所要求的濃度或制備成可吸入性顆粒受試物在氣溶膠發(fā)生過程中如使用了溶劑,應(yīng)事先掌握該溶劑的急性吸入毒性。對所選用的溶劑有充分了解時,不必同時設(shè)立溶劑對照組。對固體顆粒狀受試物應(yīng)進行機械處理以獲得粒徑大小符合要求的顆粒,但在加工過程中應(yīng)注意不引起受試物分解或發(fā)生改變,經(jīng)化學(xué)分析后可知道受試物是否發(fā)生了分解或改變。同時還要注意不要污染受試物。5.6染毒條件的監(jiān)測5.6.1吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)空氣流量每次染毒應(yīng)連續(xù)監(jiān)測通過吸入暴露系統(tǒng)的空氣流量并至少記錄3次。5.6.2吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)溫度每次染毒應(yīng)連續(xù)監(jiān)測動物呼吸帶區(qū)域的溫度并至少記錄3次。溫度應(yīng)保持在22℃±3℃范圍內(nèi)。如果超出這一范圍,則應(yīng)考慮此改變對染毒結(jié)果或毒性效應(yīng)可能產(chǎn)生的影響。5.6.3相對濕度30%-70%范圍內(nèi)。但如受試物為水性化制劑,則不做此要求。有時則是由于受到受試物的干擾,無法進行相對濕度的測定。5.6.4受試物的濃度5.6.4.1測量動物呼吸帶區(qū)域受試物的確切濃度。染毒過程中,受試物的確切濃度應(yīng)盡可能保持不變并進行連續(xù)或間歇性地監(jiān)測(取決于濃度分析方法)。如果是間歇性監(jiān)測,則每隔1h左右采樣1次。對于單一成分的固體粉末或揮發(fā)性極低的液體,可采用重量法進行濃度分析。對較高濃度組采樣并采用重量法進行濃度分析時,應(yīng)對用于測量采欄體積的流量計進行校準(zhǔn)。5.6.4.2有些液體受試物在揮發(fā)后剩余的重量恒定不變,這種情況下可采用稱重法,通過稱量揮發(fā)后剩余的重量來推算揮發(fā)前受試物的液度。如在動物呼吸帶區(qū)域含有受試物的組成成分與受試物制劑的原有組成成分類似時,則不必對其中的無活性成分進行測定,只需在試驗報告中提供此方面的結(jié)果即可。如受試物易于沉淀、含有不同的組成成分、含有可揮發(fā)性組分或其他原因難以測定吸入暴露系統(tǒng)中的受試物濃度時,則需另外進行受試物中無活性成分的分析5.6.4.3在分析受試物染毒濃度時,如不宜用重量法或產(chǎn)生的氣溶膠中含有兩種以上成分時,則可通過測定受試物主要活性成分的含量并據(jù)此推算出受試物的濃度,但必須說明其合理性。5.6.4.4如受試物是一種制劑,其染毒散度應(yīng)是制劑的濃度而不應(yīng)僅是其主要活性成分的濃度5.6.5粒徑大小分布情況(分散度)急性毒性試驗中在每4h的染毒過程中,至少應(yīng)進行2次氣溶膠分散度的測定。重復(fù)劑量毒性試驗與亞慢性毒性試驗每個濃度組每周只需測量一次氣溶膠的分散度。所選用的采樣設(shè)備應(yīng)能計算出MMAD。如受試物的氣溶膠含有多種組分時,應(yīng)按服上述原則進行受試物濃度測定。實驗室應(yīng)能證明采樣器所采集的樣本可代表動物實際吸入的氣溶膠。吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)的受試物濃度可書不列二法進行計算:記錄氣溶膠發(fā)生時單位時間內(nèi)散發(fā)到吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)的受試物總量,除以此時間內(nèi)通過吸入暴結(jié)系統(tǒng)的總空氣流量。5.7臨床檢查及病理學(xué)檢查按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范進行臨床檢查及病理學(xué)檢查。6.1試驗前準(zhǔn)備試驗前對精密動態(tài)暴露設(shè)備相應(yīng)裝置進行如下檢查,保證各部件正確連接并處于正常工作狀態(tài):a)檢查吸入暴露系統(tǒng)的嚴(yán)密性,暴露系統(tǒng)各部件正確連接;b)樣品氣溶膠發(fā)生發(fā)生裝置,加濕裝置工作狀態(tài)正常;5c)溫濕度檢測裝置、壓力檢測裝置、樣品檢測裝置、氣體濃度檢測裝置工作狀態(tài)正常d)檢測空氣壓縮裝置、氣體抽濾裝置氣路通暢;e)確保系統(tǒng)連接壓力報警裝置,且報警裝置工作狀態(tài)正常。6.2.1將口鼻式暴露裝置與液體氣溶膠發(fā)生器或粉塵氣溶膠發(fā)生器連接。6.2.2打開空氣壓縮裝置,確保暴露系統(tǒng)內(nèi)實驗動物的新鮮空氣和所要求的試驗氣壓。6.2.3打開氣體抽濾裝置,保證暴露系統(tǒng)氣流暢通且略處于負(fù)壓狀態(tài)。6.2.4打開氣溶膠發(fā)生裝置開始發(fā)生氣溶膠,調(diào)整氣流,并根據(jù)實際情況調(diào)整加濕裝置,待吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠濃度達到平衡后(達到平衡的時間可根據(jù)暴露系統(tǒng)的體積與受試物氣溶膠進入吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)的流速進行估算),開始測定吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠的濃度,以確定氣溶膠發(fā)生裝置、加濕裝置的工作條件。在此工作條件下,受試物氣溶膠在暴露系統(tǒng)內(nèi)的濃度滿足所進行的吸人毒性試驗對受試物濃度的要求6.2.5受試物濃度檢測:a)粉塵氣溶膠濃度檢測:采用重量法進行檢測,及根據(jù)單位時間內(nèi)采樣前后濾膜的重量差與采樣體積的比值計算濃度,應(yīng)注意濾膜使用前應(yīng)放置于干燥器中至少24h。按照式(1)計算暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠濃度式中:C—暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠濃度,單位為毫克每立方米(mg/m);m—采樣后濾膜重,單位為克(g):m—采樣前濾膜重,單位為克(g);v—采樣體積,單位為升(L)。b)液體氣溶膠濃度測定:設(shè)定合適的取樣氣流和取樣時間進行取樣,將受試物直接取樣至單位體積的適當(dāng)?shù)奈沼蛻?,用化學(xué)分析法(紫外分光光度法、液相色譜法、氣象色譜、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、色譜后譜聯(lián)用法等)測定吸收液中受試物的濃度。該濃度乘以收集液體積得到收集液中受試物的的是,再除以采樣體積即得到暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠的濃度。6.2.6暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠顆粒粒業(yè)檢測:待吸入景露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠濃度滿足試驗要求且達到平衡后,檢測暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠顆粒粒徑。MMAD范圍為Iμm-4μm,GSD范圍為6.2.7待吸入暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠濃度滿足試臉要求且達到平衡(濃度平行測量3次,均值在所要求濃度的±25%以內(nèi));暴露系統(tǒng)內(nèi)受試物氣溶膠顆粒滿足MMAD范圍為1μm-4μmGSD范圍為1.5~3.0;暴露系統(tǒng)內(nèi)溫度范圍滿足22℃±3℃,相對濕度范圍滿足30%~70%,迅速將試驗動物通過固定裝置連接入吸入暴露系統(tǒng),開始計時進行進行口鼻吸入毒性試驗6.2.8試驗過程中每隔1h左右采樣1次,每次采樣平行采集3個樣品進行濃度測定。6.2.9試驗過程中記錄吸入暴露系統(tǒng)的氣

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