GB/T 41185-2021 水生動(dòng)物病原DNA檢測(cè)參考物質(zhì)制備和質(zhì)量控制規(guī)范 質(zhì)粒（正式版）

ICS65.020.30GB/T41185—2021水生動(dòng)物病原DNA檢測(cè)參考物質(zhì)制備和國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T41185—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國(guó)水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC156)歸口。1GB/T41185—2021水生動(dòng)物病原DNA檢測(cè)參考物質(zhì)制備和質(zhì)量控制規(guī)范質(zhì)粒本文件給出了作為水生動(dòng)物病原DNA檢測(cè)陽(yáng)性參考物質(zhì)的質(zhì)粒，其質(zhì)量控制規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義、縮粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。本文件適用于水生動(dòng)物病原DNA核酸檢測(cè)中質(zhì)粒的制備和質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SC/T7019水生動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。變異系數(shù)coefficientofvariation初始樣frontsample按照制備先后順序，最先制備的1/3批次產(chǎn)品。質(zhì)粒中目的基因序列與病原參考毒株序列的一致性。穩(wěn)定性stability3.62GB/T41185—20213.7按照制備先后順序，中間制備的1/3批次產(chǎn)品。3.8終止樣finalsample按照制備先后順序，最后制備的1/3批次產(chǎn)品。3.9最小有效取樣量minimumeffectivesamplevolume4縮略語(yǔ)Amp:氨芐青霉素(ampicillin)Ct:擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(cyclethreshold)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dATP:三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(deoxyadenosinetriphosphate)dCTP:三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(deoxycytidinetriphosphate)dGTP:三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(deoxyguanosinetriphosphate)dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)dTTP:三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸(deoxythymidinetriphosphate)LB:營(yíng)養(yǎng)肉湯(luria-bertanibroth)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)qPCR:實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitativereal-timepolymerasechainreaction)Taq:水生嗜熱菌(Thermusaquaticus)5原理利用基因重組技術(shù)，將目的DNA片段連接入空質(zhì)粒中，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，篩選出含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒的細(xì)胞，再?gòu)募?xì)胞中提取質(zhì)粒，制備流程按照附錄A進(jìn)行。為滿足病原分子生物學(xué)6試劑或材料6.1水：符合GB/T6682中一級(jí)水規(guī)定。6.2PCR試劑和qPCR試劑：商品化試劑。6.3擴(kuò)增病原目的基因的引物：可參照相應(yīng)的國(guó)家3GB/T41185—20217儀器設(shè)備7.6熒光定量PCR儀。4GB/T41185—20219質(zhì)粒的質(zhì)量控制9.1.1PCR檢測(cè)以質(zhì)粒溶液為模板，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(水)和陽(yáng)性對(duì)照(病原DNA),進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳觀察檢在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照都成立的情況下：a)可檢測(cè)到目的DNA,且測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)病原參考株的序列同源性至少達(dá)到99%,則質(zhì)粒可作為陽(yáng)性參考物質(zhì)用于病原的定性分子生物學(xué)檢測(cè)；b)無(wú)明顯的目的DNA,或測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)病原參考株的序列同源性低于99%,則說(shuō)明病原目的9.2質(zhì)粒的定量檢測(cè)9.2.1qPCR方法分別以質(zhì)粒和空質(zhì)粒為模板進(jìn)行qPCR,對(duì)所設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行特異性檢測(cè)。DNA的定量檢測(cè)；b)檢測(cè)結(jié)果都為陽(yáng)性，則該套引物探針也可以與空質(zhì)粒某段基因反應(yīng)，不能用于目的DNA的定c)檢測(cè)結(jié)果都為陰性，則該套引物探針不能與目的DNA反應(yīng)，應(yīng)重新設(shè)計(jì)引物探針，或優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。使用分光光度計(jì)測(cè)量目的DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再根據(jù)公式(1)換算成拷貝數(shù)濃度：(6.02×1020)×N/MW=Y (1)N——目的DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為克每毫升(g/mL);MW——分子量的數(shù)值，單位為克每摩爾(g/mol);目的DNA拷貝數(shù)濃度不應(yīng)低于1010copies/μL拷貝數(shù)，若低于此濃度，應(yīng)加大DNA提取量，再5GB/T41185—20219.2.3.1將標(biāo)準(zhǔn)品(目的DNA溶液)10倍梯度稀釋5次。9.2.3.2使用9.2.1設(shè)計(jì)的引物探針，以標(biāo)準(zhǔn)品原液及5次梯度稀釋溶液為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。縱坐標(biāo)為Ct值；標(biāo)準(zhǔn)曲線R值不低于0.98。若各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值無(wú)法形成良好的線性關(guān)系，需9.2.4質(zhì)粒中病原DNA的定量9.2.4.2以水為模板設(shè)置陰性對(duì)照，以病原DNA為模板設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。9.2.4.3在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照都成立的情況下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，3個(gè)平行對(duì)照樣品Ct值分別對(duì)應(yīng)3個(gè)拷貝數(shù)，將拷貝數(shù)平均值除以反應(yīng)體系中加入的樣品體積，即為質(zhì)粒真實(shí)的拷貝數(shù)濃度。若質(zhì)粒的Ct值小于標(biāo)準(zhǔn)品原液的Ct值，需將質(zhì)粒稀釋10倍或100倍后，重新進(jìn)行定量。檢測(cè)方法推薦的方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增，觀察檢測(cè)結(jié)果。獲得陽(yáng)性結(jié)9.4.1.2分別以10份質(zhì)粒為模板，使用相應(yīng)病原檢測(cè)方法推薦的引物和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行PCR或qPCR擴(kuò)增。9.4.1.3PCR產(chǎn)物電泳，或qPCR產(chǎn)物讀數(shù)并計(jì)算變異系數(shù)。均勻性判定方法如下：a)10份質(zhì)粒樣品的檢測(cè)結(jié)果全部為陽(yáng)性，PCR擴(kuò)增的10條DNA條帶亮度相近，或qPCR得出的10份樣品Ct值變異系數(shù)≤10%,表明樣品均勻性良好；b)有樣品為弱陽(yáng)性，甚至為陰性；或qPCR的10份樣品Ct值變異系數(shù)>10%,則表明樣品均勻9.5質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測(cè)設(shè)置3組質(zhì)粒樣品，分別放置于37℃、4℃、-20℃保存。分別在第1天、第3天、第5天、第7天、第2周、第3周、第1月直至第1年時(shí)間段，每組各取3支樣品，1個(gè)樣品應(yīng)至少設(shè)3個(gè)重復(fù)，使用相應(yīng)病原檢測(cè)方法推薦的引物和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)。a)37℃至少保存7d;6GB/T41185—2021b)4℃至少保存3周；c)—20℃以下至少保存1年。9.6質(zhì)粒的保存質(zhì)粒原液分裝成50μL/管，低于-20℃條件下保存不超過(guò)1年，避免反復(fù)凍融，4℃條件下保存不超過(guò)3周。使用時(shí)取出相應(yīng)的量，根據(jù)9.2規(guī)定的方法重新檢測(cè)合格后使用。符合SC/T7019的規(guī)定。質(zhì)粒作為水生動(dòng)物病原DNA檢測(cè)參考物質(zhì)，應(yīng)經(jīng)過(guò)至少5家具備核酸提取和分子生物學(xué)檢測(cè)能經(jīng)9.1～9.6步驟檢測(cè)，質(zhì)粒應(yīng)同時(shí)滿足以下5項(xiàng)要求，才能作為水生動(dòng)物病原DNA核酸檢測(cè)參考a)重組了病原目的DNA片段，且片段序列與相應(yīng)病原的參考株序列同源性不低于99%;b)每個(gè)反應(yīng)體系的最小取樣量不高于病原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的反應(yīng)體系的加樣量；e)經(jīng)過(guò)至少5家水生動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作定值，且定值結(jié)果全部合格。7質(zhì)粒制備方法A.1試劑或材料A.1.2目的基因凝膠回收試劑和質(zhì)粒提取試劑：商品化試劑盒。A.1.4dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.A.1.6擴(kuò)增病原目的基因的引物：根據(jù)國(guó)內(nèi)外相應(yīng)病原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的引物序列合成。A.1.9X-gal:2%,按照B.2配制。A.1.10大腸桿菌感受態(tài)DH5α:商品化試劑。A.1.1250×電泳緩沖液：按照B.4配制，也可選擇商品化試劑。A.1.13溴化乙錠：10mg/mL,按照B.5配制，也可選擇商品化試劑。A.1.146×上樣緩沖液：按照B.6配制，也可選擇商品化試劑。A.1.15經(jīng)高溫高壓滅菌處理的耗材。A.2儀器設(shè)備A.2.2恒溫?fù)u床。A.2.5電子天平。A.2.6高壓滅菌鍋。A.2.7PCR儀。A.2.8熒光定量PCR儀。A.2.10紫外分光光度計(jì)。A.2.11凝膠成像系統(tǒng)。A.2.12移液器。A.3質(zhì)粒參考物質(zhì)的制備A.3.1目的DNA的擴(kuò)增PCR擴(kuò)增所使用的引物和反應(yīng)條件采用國(guó)內(nèi)外已發(fā)布的病原檢測(cè)方法中推薦的引物和反應(yīng)條件，以病原基因組DNA為模板，使用TaqDNA聚合酶及其專用緩沖液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物至少為8A.3.2PCR反應(yīng)產(chǎn)物的上樣和電泳將50×電泳緩沖液稀釋50倍，配制1%的瓊脂糖(含0.5μg/mLEB)凝膠平板。將全部PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和1/5體積的上樣緩沖液混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)使用核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照。5V/cm電泳20min～30min,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠平板2/3處時(shí)停止。在紫外燈下觀察電泳后的凝膠，切下含目的基因的條帶，放入離心管中。采用商品化凝膠回收試劑盒提取目的DNA。最后使用20μL水溶解DNA,—80℃保存?zhèn)溆?。根?jù)分子量計(jì)算目的DNA和pGEM-Teasy的摩爾濃度，質(zhì)粒連接目的基因體系應(yīng)符合表A.1要求。表A.1質(zhì)粒連接目的基因體系試劑加入量T4DNA連接酶加水至總體積25pμLA.3.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與藍(lán)白篩選A.3.5.2取100μL菌液，加入40μLX-gal溶液(2%)和7μLIPTG(20%),混勻后，均勻涂布于含A.3.5.4培養(yǎng)結(jié)果觀察：藍(lán)色菌落攜帶空質(zhì)粒，乳白色菌落攜帶質(zhì)粒；若未加入連接產(chǎn)物的菌液也生長(zhǎng)A.3.6質(zhì)粒的提取A.3.6.1挑白斑單菌落，放入3mL含100μg/mLAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌過(guò)夜。取1.5mL菌液4℃保存，剩余1.5mL菌液用于提取質(zhì)粒。9GB/T41185—2021(規(guī)范性)試劑及其配制B.1IPTG(20%)8mL水溶解2gIPTG,定容至10mL,0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝成1mL,-20℃保存。B.2X-gal(2%)用二甲基甲酰胺溶液10mL溶解0.2gX-gal,分裝成1mL,使用棕色容器或錫箔紙包裹，-20℃避光保存。B.3LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g酵母提取物5g(若配制固體LB培養(yǎng)基，再加入15g瓊脂)加800mL雙蒸水完全溶解。用10mol/L的NaOH和5mol/L的HCl調(diào)pH至7.0～7.4,再定容至1000mL,120℃高壓滅菌20min備用。B.4TAE電泳緩沖液(50×)Tris堿242g冰乙酸57.1