基因芯片課件

基因芯片目錄概述原理基本步驟制備方法應(yīng)用優(yōu)缺點展望一、概述

基因芯片（genechip,又稱DNA芯片，DNA微陣列），是生物芯片的代表。

背景：

隨著人類基因組計劃（

Humangenomeproject

）的逐步實施以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得以測定，基因序列數(shù)據(jù)正在以前所未有的速度迅速增長。然而,怎樣去研究如此眾多基因在生命過程中所擔(dān)負的功能就成了全世界生命科學(xué)工作者共同的課題。為此，建立新型雜交和測序方法以對大量的遺傳信息進行高效、快速的檢測、分析就顯得格外重要了。

基因芯片技術(shù)就是順應(yīng)這一科學(xué)發(fā)展要求的產(chǎn)物。

概念：基因芯片技術(shù)是將大量已知序列的核酸片段有規(guī)律地固定在玻璃片、硅片、尼龍膜等各種固體支持物上形成分子陣列，然后與用熒光標(biāo)記過的核酸樣品進行雜交，當(dāng)樣品與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針發(fā)生互補配對時，可以通過熒光強度來確定探針位置，獲得與探針互補的核酸序列，從而獲知樣品信息。分類

有機基因芯片載體基質(zhì)無機基因芯片

基因表達譜芯片使用功能測序芯片診斷芯片

高密度芯片探針數(shù)量中低密度芯片

二、原理

基因芯片的原理是將特定的已知核酸序列的cDNA片段或寡核甘酸片段有規(guī)律地固定在固相支撐物(硅片、陶瓷或玻璃片等)表面作為基因探針，根據(jù)堿基互補配對原則，與用熒光或放射性同位素標(biāo)記過的DNA或RNA樣品進行雜交，通過檢測系統(tǒng)的雜交信號進行分析，可以高效快速地檢測靶基因的存在量及其變異性。根據(jù)需要制備探針利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。固定于支持物上的探針,與標(biāo)記樣品的堿基不互補則探針與樣品不能進行雜交通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。正常

高表達

低表達通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析從而得到基因的表達水平檢測原理以及相關(guān)工具

由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點樣量很少，所以雜交信號較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(charged-coupleddevicecamera，CCD)攝像機等弱光信號探測裝置。

此外，大多數(shù)DNA芯片雜交信號譜型除了分布位點以外還需要確定每一點上的信號強度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是非常重要的。工具有：

（1）激光掃描熒光顯微鏡：氬離子激光器，分辨率高，圖像質(zhì)量好；

（2）激光掃描共焦顯微鏡：共焦技術(shù)，靈敏度和分辨率較高，掃描時間長，比較適合研究用。現(xiàn)在Affymetrix公司已推出商業(yè)化樣機，整套系統(tǒng)約12萬美元；

（3）采用了CCD相機的熒光顯微鏡：掃描時間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用；

（4）傳感器：實時檢測DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片。標(biāo)記物主要有：熒光標(biāo)記物（最常用）和生物素標(biāo)記物熒光標(biāo)記雜交信號的檢測方法熒光顯微鏡可以選擇性地激發(fā)和探測樣品中的混合熒光標(biāo)記物，并具有很好的空間分辨率和熱分辨率，特別是當(dāng)熒光顯微鏡中使用了共焦激光掃描時，分辨能力在實際應(yīng)用中可接近由數(shù)值孔徑和光波長決定的空間分辨率，而在傳統(tǒng)的顯微鏡是很難做到的，這便為DNA芯片進一步微型化提供了重要的檢測方法的基礎(chǔ)。

生物素標(biāo)記方法中的雜交信號探測以生物素（biotin）標(biāo)記樣品的方法由來已久，通常都要聯(lián)合使用其它大分子與抗生物素的結(jié)合物（如結(jié)合化學(xué)發(fā)光底物酶、熒光素等），再利用所結(jié)合大分子的特殊性質(zhì)得到最初的雜交信號，由于所選用的與抗生物素結(jié)合的分子種類繁多，因而檢測方法也更趨多樣化。特別是如果采用尼龍膜作為固相支持物，直接以熒光標(biāo)記的探針用于DNA芯片雜交將受到很大的限制，因為在尼龍膜上熒光標(biāo)記信號信噪比較低。因而使用尼龍膜作為固相支持物的這些研究者大多是采用生物素標(biāo)記的。三、基本步驟

生物芯片是將生命科學(xué)研究中所涉及的不連續(xù)的分析過程(如樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測)，利用微電子、微機械、化學(xué)、物理技術(shù)、計算機技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之連續(xù)化、集成化、微型化。生物芯片技術(shù)主要包括四個基本要點：芯片方陣的構(gòu)建、樣品的制備、生物分子反應(yīng)和信號的檢測。1、芯片準(zhǔn)備：先將玻璃片或硅片進行表面處理，然后使DNA片段或蛋白質(zhì)分子按順序排列在芯片上。（芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術(shù)。以便能快速、準(zhǔn)確地將探針放置到芯片上的指定位置。）2、樣品制備：生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，除少數(shù)特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應(yīng)，有時樣品的量很小。所以，必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標(biāo)記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。3、雜交反應(yīng)：雜交反應(yīng)是熒光標(biāo)記的樣品與芯片上的探針進行的反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。選擇合適的反應(yīng)條件能使生物分子間反應(yīng)處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。4、芯片信號檢測：雜交反應(yīng)后的芯片上各個反應(yīng)點的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，即可以獲得有關(guān)生物信息。

基因芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)是將從樣品制備、雜交反應(yīng)到信號檢測的整個分析過程集成化以獲得微型全分析系統(tǒng)（micrototalanalyticalsystem）或稱縮微芯片實驗室（laboratoryonachip）。使用縮微芯片實驗室，就可以在一個封閉的系統(tǒng)內(nèi)以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結(jié)果的全套操作。四、基因芯片的制備

有原位合成法和直接點樣法兩種，原位合成法一般用于制備基因芯片，直接點樣法既可以用于制備基因芯片也可以用于制備蛋白質(zhì)芯片。1、原位合成法，是指將數(shù)量眾多的電極固定在固相支持物上，電極上具有生物親和性的多孔空間，用于合成DNA片段所需的4種單核苷酸可以進入電極上的多孔空間，在電極上合成DNA片段，原位合成法又可分為光導(dǎo)原位合成法與原位噴印合成法。（1）光導(dǎo)原位合成法

光導(dǎo)原位合成法是由美國昂飛公司研發(fā)的，利用光敏保護基將堿基單體的5‘端羥基保護起來，之后固相支持物上的光敏保護基與1個核苷酸單體連接，如此循環(huán)直到合成完成。光導(dǎo)原位合成法制備探針之間的距離為5~10μm，1㎝2可以容納106個探針，這種方法的優(yōu)點是步驟簡單、合成速度快且合成探針量大，缺點是合成的探針長度不是很長。（2）原位噴印合成法

噴印合成法原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成原理一致，形式類似于噴墨打印，有多個噴印頭及墨盒，墨盒里面裝有4種堿基的液體。噴印頭可以在整個載體上任意移動，根據(jù)載體上不同位點探針的序列要求將特定的堿基噴印在特定的位置。2、直接點樣法，是指將人工合成的寡核苷酸片段直接點在固相支持物上。

直接點樣是將合成好的探針、cDNA、基因組DNA片段通過人工或高速點樣器直接點在固相支持物上。根據(jù)點樣方式不同可將直接點樣法分為接觸點樣、非接觸點樣。對于直接點樣法來說，點樣器的好壞直接決定了基因芯片的探針密度及結(jié)合強度，點樣裝置質(zhì)量的衡量指標(biāo)有點樣速度、點樣穩(wěn)定性、點樣密度等。五、基因芯片的應(yīng)用

在實際應(yīng)用方面，生物芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防、航天等許多領(lǐng)域。它將為人類認(rèn)識生命的起源、遺傳、發(fā)育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設(shè)計和藥物開發(fā)中先導(dǎo)化合物的快速篩選和藥物基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐平臺。丁香通上關(guān)于基因芯片的應(yīng)用：/experiment/430/586/587/1_index.htmAffymetrix的芯片基因表達芯片：GeneChipHumanTranscriptomeArray2.0全轉(zhuǎn)錄組基因表達芯片（HTA2.0）基因分型芯片：AxiomHumanOrigins基因分型芯片Axiom中國人基因分型芯片細胞遺傳學(xué)芯片：CytoScanHD細胞遺傳學(xué)檢測芯片Affymetrix是基因芯片技術(shù)的先驅(qū)和基因組學(xué)研究領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者，致力于研發(fā)并提供能夠在細胞、蛋白和基因水平對生物系統(tǒng)進行多重和平行分析的創(chuàng)新技術(shù)，同時致力于促進研究成果的轉(zhuǎn)化，創(chuàng)造更美好的生活。/

OncoScan芯片

Affymetrix全新的OncoScan芯片利用獨特的分子倒置探針（MolecularInversionProbe,MIP）技術(shù)，能夠快速經(jīng)濟地分析來自福爾馬林固定石蠟包埋(Formalin-fixedParaffin-embedded,FFPE)樣本的少量的高度降解的DNA，讓實體瘤癌癥分析向前邁進了一大步。

基因芯片在生物研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在：1、基因表達分析2、DNA測序3、發(fā)現(xiàn)新基因4、病原檢測5、繪制圖譜1、基因表達分析

通過基因芯片檢測生物不同發(fā)育階段或病原體不同致病階段的基因表達情況，可以研究基因的功能及病原的致病機理。

Girke等運用基因芯片對擬南芥種子發(fā)育過程進行了研究，發(fā)現(xiàn)通過基因芯片篩選到的擬南芥2600個基因中,有25％的基因在種子中的表達量是葉子及根的2倍。zhou等制備了水稻基因組表達芯片，經(jīng)過低能N+光束處理后，每30個與組蛋白相關(guān)的基因中有1個基因表達上調(diào)，每38個溴結(jié)構(gòu)域蛋白基因中有1個基因表達上調(diào)，1個基因表達下調(diào)。luan等制備了包含有13319個探針的雞基因芯片，在2周齡小雞感染沙門氏病菌前后，檢測到了588個差異表達基因，其中276個是已知功能基因，并且通過實時熒光定量PCR鑒定驗證了4個基因。2、DNA測序

利用基因芯片進行DNA測序過程如下:：將包含已知核酸探針的DNA芯片與待測的DNA樣品進行分子雜交，在DNA芯片表面可檢測到熒光信號，通過分析形成的圖譜獲知樣品序列。對已知序列進行重測序是DNA芯片的主要應(yīng)用之一，重測序指的是某種群或物種完成基因組測序后，對個體或群體的差異性分析，需要進行再測序。

DNA芯片測序具有快速、高效等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊，主要測序方法有：

SBH：sequencingbyhybridizationCSH：con-tigousstackinghybridizationCSH技術(shù)測序的長度大于SBH測序的長度

在測定植物與病原物基因組突變等方面，基因芯片是強有力的工具。

參照已知基因序列，在載體上合成大量寡核苷酸探針，與待測樣品進行雜交，兩者匹配程度越高，雜交信號越強?；蛐酒夹g(shù)測序的準(zhǔn)確率較高，國外學(xué)者利用包含大量探針的微列陣對人類線粒體基因組的序列進行測定，準(zhǔn)確率達99％。3、發(fā)現(xiàn)新基因

利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)新基因在醫(yī)學(xué)上有極其重要的意義，尤其是致癌基因的發(fā)現(xiàn)。研究人員利用基因芯片技術(shù)，篩選微生物誘導(dǎo)后的成年果蠅差異表達基因，發(fā)現(xiàn)數(shù)百個未知功能的新基因。

Yao等采用基因芯片技術(shù)，設(shè)計了乳腺癌比較基因組雜交陣列，分析了與擴增區(qū)域有關(guān)的每個基因表達水平，發(fā)現(xiàn)2個致癌新基因，分別為H2AFJ、EPS8。4、病原檢測

DNA芯片技術(shù)作為一種強有力的檢測工具，在臨床診斷、環(huán)境檢測、食品安全檢測等領(lǐng)域得到了廣泛運用。

周鈞等利用日本血吸蟲基因芯片對江西省#湖南省的釘螺進行檢測，結(jié)果顯示，江西省、湖南省感染性釘螺檢出率為100%。

張錦海等根據(jù)瘧原蟲高度保守的基因片段制備了瘧原蟲診斷、分型基因芯片，能快速診斷出瘧原蟲及其分型，對瘧疾的防治具有重要意義5、繪制圖譜

采用基因芯片探針陣列與相應(yīng)的生物信息方法可以進行基因文庫作圖。張新建等用基因芯片技術(shù)研究了水稻白葉枯病菌的侵染過程，并分析其基因表達譜，發(fā)現(xiàn)侵染過程中有5個基因發(fā)生了明顯變化。趙寶存等采用基因芯片技術(shù)獲得小麥基因的差異表達圖譜，并分析了在不同鹽脅迫時間下小麥根部基因表達的變化，包括鹽誘導(dǎo)、鹽抑制表達基因。此外：

由于心血管系統(tǒng)生理和病理過程相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是一個綜合的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要借助復(fù)雜系統(tǒng)的研究理論和方法來完成?；蛐酒夹g(shù)利用高度集成的cDNA/EST片段或寡核苷酸微陣列，可同時采集到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中多個節(jié)點的基因表達信息，因而能更好地滿足研究心血管系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的要求.因此，應(yīng)用基因表達芯片可全面研究與某一心血管疾病相關(guān)的基因群，有利于發(fā)現(xiàn)更多的心血管病基因表達水平上的標(biāo)志物。六、基因芯片的優(yōu)缺點

優(yōu)點：快速、高效、自動化。

基因芯片不僅能在早期診斷中發(fā)揮作用；與傳統(tǒng)的檢測方法相比，它可以在一張芯片上，同時對多個病人進行多種疾病的檢測；利用基因芯片，還可以從分子水平上了解疾病?；蛐酒倪@些優(yōu)勢，能夠使醫(yī)務(wù)人員在短時間內(nèi)掌握大量的疾病診斷信息，找到正確的治療措施。除此之外，基因芯片在新藥的篩選、臨床用藥的指導(dǎo)等方面，也有重要作用。不足之處：

盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，得到世人的矚目，但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技術(shù)成本昂貴、復(fù)雜、檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、分析泛圍較狹窄等問題。這些問題主要表現(xiàn)在樣品的制備、探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等幾個方面。此外價格昂貴，只有比較大的藥廠或研究所能負擔(dān)得起，所以仍未廣泛使用。（1）樣品制備：在標(biāo)記和測定前都要對樣品進行一定程度的擴增以便提高檢測的靈敏度，但仍有不少人在嘗試?yán)@過該問題，這包括MosaicTechnolo