食品安全作業(yè)

食品中沙門氏菌檢驗GB4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗檢驗儀器和材料1冰箱：0℃～4℃。2恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，42℃。3顯微鏡：10×～100×。4高壓滅菌器。5超凈工作臺。6均質(zhì)器或滅菌乳缽。7架盤藥物天平：0g～500g,精確度0.5g。8滅菌廣口瓶：500mL。9滅菌錐形瓶：500mL、250mL。10滅菌吸管：10mL（具0.1mL刻度）。11天菌培養(yǎng)皿：90mm。12滅菌小試管：內(nèi)徑3mm×50mm。13滅菌毛細(xì)管。檢驗使用的培養(yǎng)基和試劑1緩沖蛋白胨水(BP)2氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液3四硫酸鈉煌綠(TTB)增菌液4亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液5亞硫酸鉍瓊脂(BS)6DHL瓊脂7HE瓊脂：按GB/T4789.28—2003中4.21規(guī)定。8TSI瓊脂9蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑10尿素瓊脂(pH7.2)11氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基12沙門氏菌因子血清：按26種用于初步分型；57種用于進一步分型；163種用于詳細(xì)分型。檢驗沙門氏菌的樣品1鮮豬肉、鮮牛肉；凍豬肉2鮮牛奶、鮮魚；凍魚3香腸、蝦仁沙門氏菌檢驗具體流程

檢樣

前增菌法

直接增菌法

凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品

鮮肉、鮮蛋、鮮乳及其它未經(jīng)加工的食品

25g＋BP225mL

25g＋滅菌生理鹽水25mL制成檢樣均質(zhì)液（36±1）℃一般4h，干蛋品18～24h10mL＋MM(或TTB)100mL

10mL＋SC100mL

檢樣均質(zhì)液的半量＋MM(或TTB)100mL

檢樣均質(zhì)液的半量＋SC100mL42℃18～24h（36±1）℃18～24h42℃18～24h（36±1）℃18～24h

BS

DHL(或HE、WS、SS)（36±1）℃40～48h（36±1）℃18～24h

挑取可疑菌落

TSI（斜面、底層、產(chǎn)氣、H2S）、蛋白胨水（靛基質(zhì)）、尿素（pH7.2）、KCN、賴氨酸

H2S＋靛基質(zhì)－

H2S＋靛基質(zhì)＋

H2S－靛基質(zhì)－

非如左述的

尿素－KCN－賴氨酸＋

尿素－KCN－賴氨酸＋

尿素－KCN－賴氨酸＋/－

各種反應(yīng)結(jié)果

甘露醇、山梨醇

ONPG

沙門氏菌血清學(xué)實驗

沙門氏菌血清學(xué)實驗

非沙門氏菌

非沙門氏菌

報告檢驗沙門氏菌操作步驟1、前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌。以無菌操作取25g（mL），加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶內(nèi)。固體食品可先應(yīng)用均質(zhì)器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃±1℃培養(yǎng)4h(干蛋品培養(yǎng)18h～24h)，移取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18h～24h。同時，另取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。各取25g(25mL)加入滅菌生理鹽水25mL，按前法做成檢樣勻液；取25mL，接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)24h；另取25mL接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。2、分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板和一個DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板)。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h(DHL、HE、WS、SS)或40h～48h(BS)，觀察各個平板上生長的菌落。3、生化試驗自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂、蛋白陳水(供做靛基質(zhì)試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基和賴氨酸脫竣酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各1管，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h，按生化反應(yīng)初步鑒定表判定結(jié)果。按反應(yīng)序號分類，沙門氏菌屬的結(jié)果應(yīng)屬于A1、A2和B1，其他5種反應(yīng)結(jié)果均可以排除。沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ（即亞利桑那菌）BS瓊脂產(chǎn)硫化氫菌落為黑色帶有金屬光澤，棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變黑色帶有金屬光澤DHL瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色HE瓊脂WS瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色；多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中心黑色或幾乎全黑色SS瓊脂無色半透明，產(chǎn)硫化氫菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時與大腸埃希氏菌不能區(qū)別腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果斜面底層產(chǎn)氣硫化氫可能的菌屬和種－＋＋/－＋沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌＋＋＋/－＋沙門氏菌Ⅲ、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌－＋＋－沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬－＋－－傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬＋＋＋/－－大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌注：＋陽性；－陰性；＋/－多數(shù)陽性，少數(shù)陰性腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表反應(yīng)序號硫化氫（H2S）靛基質(zhì)pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結(jié)果A1＋－－－＋沙門氏菌屬A2＋＋－－＋沙門氏菌屬（少見）緩慢愛、德華氏菌A3＋－＋＋－弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異、變形桿菌A4＋＋＋＋－普通變形桿菌B1－－－－－－－－＋－沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B2－－＋＋－－－＋－大腸埃希氏菌、大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4－＋＋/－＋－摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬注1：三糖鐵瓊脂底層均產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣者可排除；斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。注2：KCN和賴氨酸可選作其中一項，但不能判定結(jié)果時，仍需補做另一項。注3：＋表示陽性；－表示陰性；＋/－表示多數(shù)陽性，少數(shù)陰性。沙門氏菌檢驗——幾點注意冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進行15min或在2-8℃，18小時內(nèi)軟化。為保證檢驗的準(zhǔn)確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠數(shù)量的菌落進行生化和血清學(xué)鑒定。進行生化反應(yīng)時，應(yīng)以純培養(yǎng)物進行試驗，如出現(xiàn)血清學(xué)陽性，而生化反應(yīng)特征不符合時，應(yīng)對接種物進行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進行生化試驗。測試中應(yīng)同時接種陽性對照菌株。食品中金黃色葡萄球菌的檢測1、增菌培養(yǎng)法1.1檢樣處理：無菌操作取樣25g（mL）加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或均質(zhì)制成混懸液。1.2增菌及分離培養(yǎng)：吸取5mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯50mL培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種血平板和BP平板，36℃±1℃培養(yǎng)24h，挑取血平板上金黃色（有時為白色）菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶實驗。2.1梯度稀釋轉(zhuǎn)種BP平板吸取上述1：10混懸液，進行10倍第次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入三塊BP平板，每個平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌涂布器涂布整個平板，如水分多不易吸收，可將平板放在36℃±1℃1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36℃±1℃培養(yǎng)。2、直接計數(shù)方法2.2轉(zhuǎn)種血平板在三個平板上尋找周圍有渾濁帶的黑色菌落，并從中任選五個菌落，分別接種血平板，于36℃±1℃培養(yǎng)24h后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養(yǎng)方法。2.3菌落計數(shù)將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。流程三法特點及適用性：第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數(shù)第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計數(shù)。GB4789.10-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB4789.10-2010第一法金