高級(jí)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR

關(guān)于高級(jí)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR15.06.2024115.06.20242常規(guī)PCR的定量在PCR反應(yīng)中，理論上擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始樣本中模板的含量成正比。但受多種因素的影響，其精確定量模板的可信度明顯不足。第2頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.20243PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá)：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示擴(kuò)增效率，Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量。第3頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.20244Realityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA第4頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.20245影響PCR擴(kuò)增效率的因素:PCR定量的困難?引物/靶的雜交反應(yīng)試劑的相對(duì)量樣本在擴(kuò)增儀中的位置的不同臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR擴(kuò)增模板的量靶核酸鏈的再退火及酶過量可致E降低第5頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.20246定量的最佳時(shí)期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.RealLifeDetectorTheoreticalLogTargetDNACycle#第6頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.20247PCR和定量問題

高濃度/高效率

高濃度/低效率

低濃度/高效率

N : 擴(kuò)增分子的數(shù)目n : 擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)log-phaseanalysisNnend-pointanalysis第7頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.20248為克服上述不足，人們設(shè)計(jì)出包括內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、競爭、酶聯(lián)、尿苷酶降解等多種定量方法。第8頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.20249內(nèi)標(biāo)法在不同的PCR反應(yīng)管中加入已知量的內(nèi)標(biāo)模板和引物，內(nèi)標(biāo)模板可由基因工程合成或采用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品。在樣品模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)模板也被擴(kuò)增。二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過電泳或其它方法分離，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照進(jìn)行樣本模板定量。第9頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202410定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法

在擴(kuò)增檢測待測樣本的同時(shí)，擴(kuò)增一系列稀釋的已知標(biāo)準(zhǔn)（通常為質(zhì)粒DNA）如果在該標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列范圍內(nèi)，擴(kuò)增產(chǎn)物/模板成線性相關(guān)，則可推導(dǎo)出同時(shí)擴(kuò)增的待測樣本中PCR模板的相對(duì)量第10頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202411定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法第11頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202412定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法優(yōu)點(diǎn)：方法簡便，容易建立使用雙孔重復(fù)測定可得到非常準(zhǔn)確的結(jié)果甚至可排除管間的差異不能排除樣本間的差異第12頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202413定量PCR

——外標(biāo)準(zhǔn)方法缺點(diǎn)PCR反應(yīng)體系的微小區(qū)別也會(huì)對(duì)測定造成較大的影響在擴(kuò)增效率上的差異，會(huì)使定量測定精密度和重復(fù)性不佳第13頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202414使用外標(biāo)定量的要求必須進(jìn)行方法的精密度（批內(nèi)變異）和重復(fù)性（批間變異）分析，以確定其應(yīng)用的局限性必須在擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行第14頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202415競爭法將含有一個(gè)新內(nèi)切酶位點(diǎn)的外源性模板加入PCR反應(yīng)管中，待測樣品模板與外源性模板用同一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)內(nèi)切酶消化競爭性模板的產(chǎn)物成為兩個(gè)片段，通過電泳等分離檢測，根據(jù)已知模板的量推測未知模板的起始拷貝數(shù)。第15頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202416酶聯(lián)免疫利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固定在固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，檢測酶底物顯色情況，通過內(nèi)標(biāo)－標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)定量檢測的目的。第16頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202417酶聯(lián)雜交法捕獲探針（檢測TNF-α）

3'–TCGGCGTAGCGGCAGAGGATGGTCT-CCCCCC-NH2-5'檢測探針（檢測TNF-α）

3'-

Biotin-TTGGGGCTCACTGTTCGGACATCGGGTA-5'第17頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202418

：NH2標(biāo)記的探針

：Biotin標(biāo)記的探針Avidin-HRP顯色系統(tǒng)

：NOS基團(tuán)酶聯(lián)雜交法第18頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202419定量PCR

——?jiǎng)恿W(xué)方法

首先，確定PCR擴(kuò)增的效率（E）然后，根據(jù)相應(yīng)的公式計(jì)算原始模板數(shù)第19頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202420影響PCR擴(kuò)增效率（E）的因素整個(gè)擴(kuò)增過程中：E取決于：引物/靶核酸的雜交反應(yīng)試劑的相對(duì)量DNA聚合酶/靶核酸之比例*其他可能影響E的因素（系統(tǒng)之間的差異）樣本在擴(kuò)增儀中的位置不同的臨床樣本中DNA聚合酶抑制物的去除程度靶核酸鏈的再退火及酶過量可致Ev降低第20頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202421改良方法：極限稀釋分析首先將原始模板進(jìn)行梯度稀釋然后對(duì)該稀釋系列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測定最低的陽性樣本被認(rèn)為含有與一已知的標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列中最后的陽性樣本中相同量的PCR模板第21頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202422

極限稀釋法示意圖第22頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202423

極限稀釋法優(yōu)點(diǎn)：不需要特殊設(shè)備方法簡單缺點(diǎn)：第23頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202424

極限稀釋分析的缺點(diǎn)①必須建立擴(kuò)增反應(yīng)條件的標(biāo)準(zhǔn)化：如初始含量、試劑濃度和比例、循環(huán)參數(shù)等②不同批次的PCR測定的效率有可能不同，因而測定重復(fù)性較差③含低拷貝數(shù)的樣本中存在高斯（Gaussian）（正態(tài)）分布。因此，為正確判定最低陽性樣本，必須對(duì)每一稀釋度多次重復(fù)測定

嚴(yán)格注意污染，避免假陽性的產(chǎn)生第24頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202425傳統(tǒng)PCR定量方法的特點(diǎn)和不足1.定量的準(zhǔn)確度：傳統(tǒng)PCR定量方法的共同特點(diǎn)是針對(duì)PCR擴(kuò)增的最終產(chǎn)物進(jìn)行分析。因受酶活性、擴(kuò)增效率、尤其是平臺(tái)效應(yīng)等諸多因素的影響，檢測重現(xiàn)性極差，無法直接從終產(chǎn)物量推算出起始模板的精確含量。第25頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.2024262.假陽性污染：傳統(tǒng)PCR定量方法均依賴于各種不同類型的PCR后處理過程，這些過程極易使數(shù)量巨大的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物飛散到實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境中，造成待檢樣本的污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的上升。傳統(tǒng)PCR定量方法的特點(diǎn)和不足第26頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202427實(shí)時(shí)熒光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對(duì)每一循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物DNA片段的累積情況進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測記錄，通過數(shù)學(xué)模型實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性的分析。其特點(diǎn)為全封閉（污染少）、高精確、高靈敏。第27頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202428實(shí)時(shí)熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別常規(guī)PCR：

通過電泳、酶聯(lián)等后處理技術(shù)，對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終末產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：通過引入DNA結(jié)合熒光染料或熒光探針，對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程中每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量及定性分析。第28頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202429PCRRealtimePCRS1S2M實(shí)時(shí)熒光定量與常規(guī)PCR的區(qū)別第29頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202430在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）：在兩個(gè)不同的熒光基團(tuán)中，如果一個(gè)熒光基團(tuán)（供體）的發(fā)射光譜與另一基團(tuán)（受體）的激發(fā)光譜有一定的重疊，當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)之間的距離足夠近（小于100?）時(shí)，以供體基團(tuán)的激發(fā)波長進(jìn)行激發(fā)，可獲得由受體基團(tuán)發(fā)射的熒光。第30頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202431即：在供體基團(tuán)的激發(fā)狀態(tài)下由一對(duì)偶極子介導(dǎo)的能量直接轉(zhuǎn)移給了受體。在此過程中沒有光子的參與，是非輻射性的能量轉(zhuǎn)移過程，轉(zhuǎn)移效率與供體－受體兩個(gè)基團(tuán)之間距離的6次冪倒數(shù)成正比例。第31頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202432FRET產(chǎn)生條件1.存在熒光供體和受體，而且供體的發(fā)色光譜與受體的激發(fā)光譜有重疊常用的FRET組合：

CFP-YFP/CFP-dsRED/BFP-GFP/GFP-dsRED/YFP-dsRED/Cy3-Cy5/Alexa488-Alexa555/Alexa488-Cy3/FITC-TRITC/YFP-TRITC/YFP-Cy3

第32頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202433

2供體和受體的距離足夠近：1-10nm

（1－10nm為分子內(nèi)/間互作的距離：如蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變、酶催化反應(yīng)等。）

——超顯微觀察

3合適偶極方向

4足夠熒光壽命 無FRETFRETFRET產(chǎn)生條件第33頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202434熒光域值線（fluorescencethresholdline）：背景熒光與熒光信號(hào)的分界值，可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線或經(jīng)驗(yàn)來設(shè)定，常設(shè)定為初始3-7個(gè)循環(huán)熒光值標(biāo)準(zhǔn)差的10倍。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第34頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202435閾值第35頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202436ThresholdlineC(t)valueCt值：是在PCR擴(kuò)增過程中，各反應(yīng)管的熒光信號(hào)與熒光域值線的交叉點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)（指數(shù)擴(kuò)增的開始階段）。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中常用的概念第36頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202437CT值熒光信號(hào)穿過閾值線時(shí)的循環(huán)次數(shù)第37頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202438

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值存在線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可對(duì)樣本中目標(biāo)基因的含量進(jìn)行精確計(jì)算。初始模板濃度的確定第38頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202439DetermineC(t)valueforunknownInterpolatequantityofunknownusingthestandardcurveunknown104103Unknowncontains3108copies第39頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202440用Ct值定量的意義實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法利用循環(huán)閾值（Ct）的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢測，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。

第40頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202441

相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖

終點(diǎn)處檢測產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性

第41頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202442絕對(duì)定量成為可能靈敏度高：可檢測10–100個(gè)細(xì)胞中１個(gè)拷貝數(shù)量的基因低拷貝基因的檢測細(xì)小倍數(shù)差異樣品的檢測實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢第42頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202443線性范圍寬(6-9個(gè)數(shù)量級(jí))，無需稀釋高濃度樣品可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測定量高表達(dá)和低表達(dá)基因熒光探針使PCR產(chǎn)物檢測特異性進(jìn)一步提高全封閉無PCR后處理*幾乎沒有污染機(jī)會(huì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)勢第43頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202444

相對(duì)定量和絕對(duì)定量：相對(duì)定量指的是確定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本中靶序列量的變化值，絕對(duì)定量指的是確定樣本中靶序列的拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法第44頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202445相對(duì)定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法比較Ct值法絕對(duì)定量的方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法第45頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202446標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對(duì)量是未知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)稀釋制成曲線，用以計(jì)算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列與標(biāo)準(zhǔn)序列的比值。相對(duì)定量方法第46頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202447比較Ct法:運(yùn)用數(shù)學(xué)公式計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到Ct值來計(jì)算起始模板的量。前提：靶基因和內(nèi)源控制物的擴(kuò)增效率基本一致。相對(duì)定量方法第47頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202448標(biāo)準(zhǔn)曲線法：制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)序列的絕對(duì)量是已知的，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)稀釋制成曲線，用以計(jì)算樣本靶序列的含量，結(jié)果為樣本靶序列的絕對(duì)含量。質(zhì)粒DNA和體外轉(zhuǎn)入的RNA常用作絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來換算成其拷貝數(shù)。絕對(duì)定量方法第48頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202449DNA結(jié)合染色：SYBRGreen1水解探針：TaqManMolecularBeacons熒光標(biāo)記引物雜交探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用的熒光化學(xué)方法第49頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202450SYBRGreenISYBRGreen1第50頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202451SYBRGreenI工作原理SYBRGreen1

結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen1

染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第51頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202452BoundSYBRGreenIUnboundSYBRGreenIPCRSYBRGreenIfluorescenceincreasesuponbindingdsDNAPost-amplificationmeltingcurveanalysisSYBRGreenI工作原理第52頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202453SYBRGreenI工作原理第53頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202454熒光強(qiáng)度Vs溫度熒光強(qiáng)度的變化是由于溫度不斷升高雙鏈DNA解離，SGI重新游離到溶液中Tm是熔解曲線的特征值TemperatureincreasesFluorescencedecreasesTmSYBRGreenI熔解曲線分析第54頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202455以熒光值隨溫度變化作負(fù)導(dǎo)-dIdTTmSYBRGreenI熔解曲線分析第55頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202456SYBRGreen熔解曲線分析

第56頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202457SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便--不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜第57頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202458SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)反應(yīng)體系的組成：傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系+SYBRGreenI1.SG濃度：終濃度1:5,000－1:100,000，一般為1:10,000—1:70,000第58頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202459

2.Primer濃度：設(shè)計(jì)原則同普通PCR

終濃度50nM－300nM

固定模板濃度的梯度實(shí)驗(yàn)不加模板的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（NTC）

——有無非特異信號(hào)SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)第59頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202460

熔解曲線的分析——是否單峰

建議使用HPLC純化的引物3.MgCl2濃度

降低MgCl2濃度以減少非特異性產(chǎn)物

最低可至1.5nM同時(shí)做梯度實(shí)驗(yàn)和NTC對(duì)照SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)第60頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202461

4.反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù)：反應(yīng)溫度參考所用酶的種類；退火溫度使用溫度梯度功能優(yōu)化；反應(yīng)時(shí)間與常規(guī)PCR類似；擴(kuò)增片斷一般為200－300bp。SYBRGreenI反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)第61頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202462不同讀板溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響：80℃第62頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202463不同讀板溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響：86℃第63頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202464

SYBRGreenI的特點(diǎn)和不足不涉及特異的探針，方法設(shè)計(jì)簡單，特異性差；熒光強(qiáng)度依賴于體系中所有的dsDNA分子，不能區(qū)分引物二聚體、非特異性擴(kuò)增片斷等；通過繪制溶解曲線可較好地保證特異性。

第64頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202465優(yōu)化的讀板溫度

-高于非特異產(chǎn)物的Tm值

-低于目標(biāo)產(chǎn)物的Tm值A(chǔ)mpliconNon-specificproducts熔解曲線分析的應(yīng)用第65頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202466TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第66頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202467TaqMan目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑5’熒光素3’淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)第67頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202468RQReporterQuencherRQIntactprobe-reporterquenchedbyFRETFRRQDuringPCR,probehybridizestotargetsequenceRQProbeispartiallydisplacedduringextensionRQProbecleavedby5’-3’nucleaseactivityofpolymeraseRQFreereporterexhibitsunquenchedfluorescenceTaqMan工作原理第68頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202469Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)引物、探針設(shè)計(jì)原則：優(yōu)先選擇探針的序列；Tm值應(yīng)比引物的Tm值高8－10度（68－70）；GC含量：30－80％；長度不應(yīng)超過30堿基，18-30bp,optimal20；5’端不應(yīng)是G，G有可能會(huì)淬滅熒光素。第69頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202470Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)選擇合適的模板鏈，使探針的Cs>Gs；擴(kuò)增片斷不超過400bp，通常為80－150bp。避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)，特別是四個(gè)或四個(gè)以上Gs連續(xù)出現(xiàn)；引物應(yīng)盡量靠近探針；引物的Tm值為59－60度，長度約20堿基；避免引物、探針之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)。第70頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202471引物、探針濃度的優(yōu)化目標(biāo)：最高的信號(hào)/背景比，最小的Ct值引物濃度：50nM－900nM

探針濃度：50nM－250nM

通過多次實(shí)驗(yàn)確定各自的濃度和比例Taqman探針反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)第71頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202472Taqman探針的不足采用熒光淬滅及雙末端標(biāo)記，淬滅難以徹底，本底較高；采用酶外切活性，受酶性能影響；探針標(biāo)記成本較高。改進(jìn)：用不發(fā)光的淬滅熒光分子取代TAMRA第72頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202473Molecular

BeaconsMolecularBeacons發(fā)夾型雜交探針第73頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202474MolecularBeacons莖由互補(bǔ)配對(duì)的序列組成環(huán)與目標(biāo)序列完全配對(duì)莖熒光素淬滅劑環(huán)第74頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202475Target-loopinteractionmorestablethanstem-stemTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTargetDuringtheannealingstep:ProbebindstargetReporterandquencherseparatedTarget-specificfluorescenceMolecularBeacons

第75頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202476MolecularBeacons特點(diǎn)和不足對(duì)目標(biāo)序列有很高的特異性；是用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一；采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低；不能完全與模板結(jié)合，穩(wěn)定性差；探針合成標(biāo)記較復(fù)雜。第76頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202477引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站

1．引物/探針的設(shè)計(jì)

?

Primer3(WhiteheadInstitute,MIT)

/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

?

GeneFisher(BielefeldUniversity)

http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/gf_submit?mode=STARTUP&qid=na&sample=dna

?

第77頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202478

1．引物/探針的設(shè)計(jì)

?

FastPCR(Biocenter,UniversityofHelsinki)

http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-1_html/oligos.htm

?

PerlPrimer(OwenMarshall)

/

?

PrimerDesignAssistant(DivisionofBiostatisticsandBioinformatics,NationalHealthResearchInstitutes)

.tw/primer/

引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第78頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202479．2.反轉(zhuǎn)錄(RT)PCR引物設(shè)計(jì)

?

ExonPrimer(TechnischeUniversit?t,München)

http://ihg.gsf.de/ihg/ExonPrimer.html

?

AutoPrimer(DeutschesKrebsforschungszentrum)

http://www.autoprime.de/

3.引物特異性的驗(yàn)證

?

Blast(NCBI) /BLAST/引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第79頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202480

?

GeneWalker(Cybergene)

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html

?

OligonucleotideAnalyzer(RNAture)

/oligonucleotide.html

?

OligonucleotidePropertiesCalculator(NorthwesternUniversity)

/biotools/oligocalc.html

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第80頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.2024815．?dāng)U增子二級(jí)結(jié)構(gòu)的評(píng)估

?

mfold(MichaelZuker,RensselaerPolytechnicInstitute)

/applications/mfold/old/dna/

引物/探針設(shè)計(jì)和評(píng)估相關(guān)的免費(fèi)網(wǎng)站第81頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202482實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測；腫瘤研究；基因表達(dá)研究；免疫組份分析；基因突變及多態(tài)性的研究第82頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202483實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

病原體檢測：檢測患者血清中肝炎病毒濃度為臨床藥物治療和療效觀察提供依據(jù)；檢測HIV的量預(yù)測發(fā)病時(shí)間；選擇治療藥物：干擾素對(duì)肝炎病毒高拷貝者不敏感，對(duì)低拷貝者敏感。第83頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202484實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

腫瘤研究：癌基因及其相關(guān)基因的定量檢測可進(jìn)行腫瘤的早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷；檢測治療中和治療后微量殘余惡性細(xì)胞存在的數(shù)量，作為治療效果和估計(jì)復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性的依據(jù)。第84頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202485基因差異表達(dá)研究標(biāo)準(zhǔn)曲線法

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定基因表達(dá)上的差異相對(duì)定量法(2－△△Ct法)

不使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接分析得到基因差異表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系第85頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202486標(biāo)準(zhǔn)曲線法步驟：1.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線分別測出目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的量2.均一化校正（Normalization)3.比較不同樣品間目標(biāo)基因表達(dá)差異第86頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202487相對(duì)定量法前提目標(biāo)基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致，且接近100％。步驟通過實(shí)時(shí)熒光曲線得到目標(biāo)基因和看家基因的Ct值均一化校準(zhǔn)△Ct=Ct目標(biāo)基因－Ct看家基因△△Ctn=△Ctn－△Ct0（不同時(shí)間、不同組織)基因差異表達(dá)的倍數(shù)＝2－△△Ct第87頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202488基因突變及多態(tài)性-SNP檢測第88頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202489基因分型方法

使用TaqMan探針

(雙色法)溶解曲線

(單色法)序列特異PCR(單色法)第89頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202490FRFQGVQTCSNPG/AFQGVQTForwardprimerReverseprimerAllele-specificprobeAllele-specificprobe用TaqMan探針進(jìn)行基因型分析SNP檢測-基因型分析第90頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202491QF5’GCQ5’3’CGFQV5’3’CTQ5’3’HybridizationofTaqManProbeDigestionofprobe-fluorescenceNOdigestionofprobe-NOfluorescenceTVQGFQMatchforAllele1ReducedEfficiencyofProbeHybridizationMismatchforAllele1Polymerase多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第91頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202492從病人血液樣品中提取DNA基因型分類：A/A(Allele1)G/G(Allele2)G/A(Heterozygote)CFQTVQ多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第92頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202493Allele1controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第93頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202494Allele2controlVICFAM多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第94頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202495HeterozygotecontrolFAMVIC多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第95頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202496VICFAM第96頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202497多色雙通道技術(shù)應(yīng)用-基因型分析第97頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202498SYBRGreenI進(jìn)行SNP分析T5’PCRprimerswithSNPsiteat3’endC5’

末端不匹配會(huì)導(dǎo)致PCR效率上有大約1000倍的差異，由此導(dǎo)致產(chǎn)物積累會(huì)有10個(gè)cycles延遲

末端匹配與否，與反應(yīng)終產(chǎn)物量的多少?zèng)]有必然聯(lián)系

PCR#1PCR#2第98頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.202499SYBRGreenI進(jìn)行SNP分析MatchMismatch第99頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.2024100SYBRGreenI進(jìn)行基因分型Amplicon1Amplicon2GCHigherTm…distinctthermalprofileLowerTm…distinctthermalprofile第100頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.2024101SYBRGreenI進(jìn)行基因分型Intensity-dI/dT第101頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.2024102TaqMan?MicroRNA分析方法

加長靶基因的反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR第102頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.2024103miRNAs的研究

MicroRNAs是一種內(nèi)源性長度在２２個(gè)堿基左右的RNA分子，它在動(dòng)植物中具有重要的基因調(diào)控作用，它們通過與mRNAs結(jié)合抑制翻譯或造成mRNAs被酶解切割而起作用目前在各種生命體中發(fā)現(xiàn)的miRNAs類型共有約700種以上,通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證或經(jīng)數(shù)據(jù)庫和軟件推測其中人源的約有２００種高豐度存在：平均每個(gè)細(xì)胞中約有50,000個(gè)拷貝第103頁,共116頁，星期六，2024年，5月15.06.2024104為什么miRNAs非常重要?MicroRNAs是一類新的基因調(diào)控因子某些miRNAs控制了動(dòng)植物的發(fā)育理解miRNA的功能將幫助現(xiàn)在流行的siRNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果：RNA干擾／基因沉默MicroRNAs有可能成為新型的疾病標(biāo)志物