硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxinreductase,TrxR）試劑盒說明書

第第頁硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxinreductase,TrxR）試劑盒說明書硫氧還蛋白氧化還原酶（thioredoxinreductase,TrxR）試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測(cè)定之前選擇23個(gè)預(yù)期差別大的樣本做猜測(cè)定。測(cè)定意義：TrxR是一種NADPH倚靠的包含F(xiàn)AD結(jié)構(gòu)域的二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸二硫化物氧化還原酶家族成員，與硫氧還蛋白以及NADPH共同構(gòu)成了硫氧還蛋白系統(tǒng)。TrxR與GR活性仿佛，催化GSSG還原生成GSH，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一、測(cè)定原理：TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征汲取峰，通過測(cè)定412nm波優(yōu)點(diǎn)TNB的加添速率，即可計(jì)算TrxR活性。自備儀器和用品：低溫離心機(jī)、可調(diào)整移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸餾水。試劑構(gòu)成和配制：試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保管。試劑二：液體2mL×1瓶，4℃避光保管。試劑三：粉劑×1管，4℃保管。臨用前加入2mL蒸餾水溶解。粗酶液提取：1.組織：依照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。2.細(xì)菌、真菌：依照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。3.血清等液體：直接測(cè)定。TrxR測(cè)定操作：1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)整波長(zhǎng)到412nm，用蒸餾水調(diào)零。2.試劑一在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）預(yù)熱30min。3.空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，160μL試劑一，快速混勻后于412nm測(cè)定10s和310s吸光度，記為A1和A2、△A空白管=A2A1、4.測(cè)定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL試劑二，20μL試劑三，140μL試劑一，20μL上清液，快速混勻后于412nm測(cè)定10s和310s吸光度，記為A3和A4、△A測(cè)定管=A4A3、注意：空白管只需測(cè)定一次。TrxR活性計(jì)算公式：a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）.按蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/mgprot）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=147×（△A測(cè)定管△A空白管）÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/g鮮重）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=147×（△A測(cè)定管△A空白管）÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/104cell）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=147×（△A測(cè)定管△A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/mL）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T=147×（△A測(cè)定管△A空白管）ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×104L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），5min。b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）.按蛋白濃度計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/mgprot）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=294×（△A測(cè)定管△A空白管）÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣本每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/g鮮重）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=294×（△A測(cè)定管△A空白管）÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/104cell）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=294×（△A測(cè)定管△A空白管）÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計(jì)算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmolDTNB還原為1個(gè)酶活單位。TrxR（nmol/min/mL）=（△A測(cè)定管△A空白管）÷ε÷d×V反總÷V樣÷T=294×（△A測(cè)定管△A空白管）ε：TNB在412nm處的微摩爾消光系數(shù)，0.0136L/μmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積（L），200μL=2×104L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），20μL=0.0